基于免标记的荧光探针构建的FEN1酶活性检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了免标记的荧光探针及其制备方法和应用，所述免标记的荧光探针的制备方法如下：将金纳米粒子与ssDNA溶液混合后涡旋5~10秒得到混合溶液，在混合溶液加入柠檬酸缓冲溶液，3~5分钟后加入HEPES缓冲溶液，离心洗去多余ssDNA即得。本发明专利技术还公开了基于免标记的荧光探针构建的FEN1酶活性检测方法及其在细胞成像中的应用。本发明专利技术不需要借助昂贵精密仪器检测，简化了检测方法，极大地降低了检测FEN 1酶的检测成本，本发明专利技术具有运行成本低、检测快速简便、选择性好、灵敏度高等优点。此外，所制备的荧光探针具有较好的生物相容性和低毒性特点，可以进入细胞，进行体内检测。

Detection method and application of Fen1 enzyme activity based on the construction of fluorescent probe without labeling

【技术实现步骤摘要】
基于免标记的荧光探针构建的FEN1酶活性检测方法及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及基于免标记的荧光探针构建的FEN1酶活性的检测方法及其应用。
技术介绍
瓣状核酸内切酶(FEN1)是一种金属依赖性核酸酶，它只识别特定的结构而不依赖于序列，主要切除双链DNA中悬挂的5’-端序列。在生物体内参与DNA复制和损伤修复过程，主要涉及冈崎片段成熟和长片段碱基切除修复。然而，过表达的FEN1酶会促进肿瘤细胞的增值、分化。研究表明，相比于正常组织，肿瘤组织内的FEN1酶含量更高，而且，过表达的FEN1酶与肿瘤的大小、分化程度以及TNM分期有关。因此，FEN1酶可以作为一种新型的肿瘤标志物，通过检测生物体内FEN1酶的含量来预判肿瘤的发生、发展。在过去的几十年里，FEN1酶曾作为辅助酶广泛应用于生物传感器的构建，主要起到信号循环放大的作用。但是，把FEN1酶作为检测对象的研究却不是很多，尤其是定量分析检测。尽管困难重重，我们还是构建出一种免标记的荧光探针对FEN1酶进行定量检测，而且进行了细胞成像。与传统的酶联免疫吸附测定(ELISA)方法相比，荧光方法操作更为简单，检测灵敏度更高，而且免标记省去了许多繁琐的标记步骤。因此，免标记的荧光探针的构建更利于FEN1酶活性的定量检测。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种基于免标记的荧光探针及其制备方法和应用。本专利技术还要解决的技术问题是还提供了基于免标记的荧光探针构建的FEN1酶活性的检测方法及在细胞成像中的应用。本专利技术不需要复杂的标记过程，简化了检测方法，极大地降低了FEN1酶检测成本，具有运行成本低、检测快速、简便、选择性好等优点。此外，所制备的免标记的荧光探针具有较好的生物相容性和低毒性特点，可以进入细胞，进行体内检测。技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术提供了免标记的荧光探针的制备方法，所述免标记的荧光探针的制备方法如下：将金纳米粒子与ssDNA溶液混合后涡旋5～10秒得到混合溶液，在混合溶液加入柠檬酸缓冲溶液，3～5分钟后加入HEPES缓冲溶液，离心洗去多余ssDNA即得。其中，所述金纳米粒子浓度为10～12nM，ssDNA浓度为100nM。其中，所述柠檬酸缓冲溶液为500mM柠檬酸，pH2.5～3.5；HEPES缓冲溶液为500mMHEPES，pH6.5～7.5。本
技术实现思路
还包括所述的制备方法制备得到的免标记的荧光探针。本
技术实现思路
还包括所述的基于免标记的荧光探针构建的FEN1酶活性检测方法，所述检测方法包括以下步骤：将所述的免标记的荧光探针与酶反应缓冲溶液混合，然后加入FEN1酶，最后再加入荧光信号分子，保持黑暗环境，在室温下反应一段时间后得到溶液，记录溶液的荧光光谱，通过荧光强度得出FEN1酶的浓度。其中，所述荧光探针与酶反应缓冲溶液的体积比0.1～1。其中，所述荧光信号分子为OliGreen溶液，所述OliGreen溶液稀释倍数为0.5～1x104倍。其中，所述酶反应缓冲溶液为50mMTris-HCl、10mMMgCl2，pH6～8。本
技术实现思路
还包括所述的免标记的荧光探针、所述的FEN1酶活性检测方法在细胞成像中的应用。其中，所述细胞含有FEN1酶的任何细胞。具体的，所述的细胞可以但不仅限于正常肝脏细胞(LO2)，肝脏癌细胞(A549和HepG2)和乳腺癌细胞(MCF-7)等。具体地，本专利技术所述荧光探针的合成：100μL的13nm的金纳米粒子与2μL100nM的ssDNA混合均匀后静置3分钟；然后加入2μLpH3.0的柠檬酸缓冲溶液，混合均匀后静置3分钟，最后加入6μLHEPES缓冲溶液，使混合溶液恢复中性环境。最后离心去除多余的ssDNA(12000rpm，10分钟)。保留沉淀，复溶后进行后续实验。具体地，不同浓度FEN1酶检测步骤及标准曲线获得：将含有5μL制备的免标记的荧光探针、50μL酶反应缓冲溶液和不同浓度的FEN1酶混合均匀后在37℃温育2小时。接下来，将5μLOliGreen溶液(0.005x)和Tris-HCl缓冲溶液在黑暗环境下室温反应15分钟，最终溶液体积为200μL。在室温下记录荧光光谱，得出荧光强度与不同浓度FEN1酶的校准曲线。本专利技术通过不同浓度FEN1酶的校准曲线，采用同样的检测步骤获得待测的FEN1酶浓度。其中，所述酶缓冲溶液为50mMTris-HCl、10mMMgCl2，pH6～8。有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下的特色及优点：本专利技术原理简单、实验周期短、所用原料成本较低，无需任何大型仪器，在相同条件下可以检测出更低含量的待测物。OliGreen与ssDNA结合后会产生荧光，但是由于距金纳米粒子表面较近，在没有FEN1酶存在的条件下，产生的荧光会被金纳米粒子猝灭。在有FEN1酶存在的条件下，FEN1酶会将悬挂的5’-端DNA序列切除，使其远离金纳米粒子表面，得到较强的荧光信号。本专利技术不需要借助昂贵精密仪器检测，简化了检测方法，极大地降低了FEN1酶检测成本，本专利技术具有运行成本低、检测快速简便、选择性好、灵敏度高等优点。此外，所制备的荧光探针具有较好的生物相容性和低毒性特点，可以进入细胞，进行体内检测。附图说明图1显示了基于免标记的荧光探针构建的FEN1酶活性的检测及细胞成像分析方法的流程图；图2显示了基于免标记的荧光探针构建的FEN1酶活性的检测及细胞成像分析方法的原理图；(a)AuNPs-ssDNA，(b)OliGreen，(c)OliGreen/AuNPs，(d)OliGreen/AuNPs-ssDNA，(e)OliGreen/FEN1/AuNPs-ssDNA图3A显示了金纳米粒子的透射电子显微镜(TEM)图像；图3B显示了金纳米粒子的粒径分布图像；图3C显示了金纳米粒子和荧光探针的紫外吸收光谱图；图3D显示了金纳米粒子和荧光探针的Zeta电位图；图4A显示了在不同浓度FEN1酶浓度(a-j分别对应浓度为0U、0.05U、0.1U、0.25U、0.5U、0.75U、1.0U、1.5U、2U、4U)作用下得到的荧光光谱图；图4B显示了荧光强度与不同浓度FEN1酶的校准曲线。(插图：荧光强度与FEN1酶对数浓度之间的线性关系，范围为0.05U～2U)；图5显示了免标记的荧光探针和OliGreen溶液对不同细胞的毒性；横坐标柱状图从左至右依次为LO2细胞，MCF-7细胞，HepG2细胞和A549细胞。图6显示了不同细胞内检测FEN1酶的共聚焦图像。具体实施方式下面通过具体的实施例和附图对本专利技术进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本专利技术的保护范围。本实验中用到的试剂和仪器：四水合氯金酸(HAuCl4·4H2O)、二水合柠檬酸三钠(C6H5Na3O7·2H2O)、柠檬酸、盐酸、三(羟本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.免标记的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述免标记的荧光探针的制备方法如下：将金纳米粒子与ssDNA溶液混合涡旋后得到混合溶液，在混合溶液加入柠檬酸缓冲溶液，然后加入HEPES缓冲溶液，离心洗去多余ssDNA即得。/n

【技术特征摘要】
1.免标记的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述免标记的荧光探针的制备方法如下：将金纳米粒子与ssDNA溶液混合涡旋后得到混合溶液，在混合溶液加入柠檬酸缓冲溶液，然后加入HEPES缓冲溶液，离心洗去多余ssDNA即得。


2.根据权利要求1所述的免标记的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述金纳米粒子浓度为10~12nM，所述ssDNA浓度为100nM。


3.根据权利要求1所述的免标记的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述柠檬酸缓冲溶液为500mM柠檬酸，pH2.5~3.5；HEPES缓冲溶液为500mMHEPES，pH6.5~7.5。


4.权利要求1~3任一项所述的制备方法制备得到的免标记的荧光探针。


5.基于免标记的荧光探针构建的FEN1酶活性检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：将权利要求4所述的免标记的荧光探针与酶反应缓冲溶液混合，然后加...

【专利技术属性】
技术研发人员：卫伟，王晨晨，刘松琴，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32