一种用于酶底物法检测大肠杆菌的荧光信号增强方法技术

本发明专利技术涉及一种用于酶底物法检测大肠杆菌的荧光信号增强方法，属于大肠杆菌检测技术领域。本发明专利技术的方法针对的酶底物为MUG，解决现有技术中采用366nm激发和450nm发射组合，MUG本底经366nm激发后，在450nm也有一定荧光强度，当大肠杆菌浓度很低时4‑MU产量少，产物信号与本底信号分不开，导致对于大肠杆菌浓度极低的水样用现有方法无法检测的技术问题。本发明专利技术的用于酶底物法检测大肠杆菌的方法，采用在温育结束之后和荧光测量之前增加一步操作。其操作为用碱性试剂调节至pH≥9，可以使产物4‑MU的吸收峰明显增强，底物MUG吸收峰变化很小，从而将产物信号与本底信号分开。使用本发明专利技术的操作使产物信号与本底信号的荧光强度差值增加5倍，突出适用于极低浓度大肠杆菌的检测。

A fluorescence signal enhancement method for detection of Escherichia coli by enzyme substrate method

【技术实现步骤摘要】
一种用于酶底物法检测大肠杆菌的荧光信号增强方法
本专利技术涉及大肠杆菌检测
，具体涉及一种用于酶底物法检测大肠杆菌的荧光信号增强方法。
技术介绍
大肠杆菌作为粪源性污染的指示微生物，检出意义重大。基于代谢学检测大肠杆菌的方法，因具有检测范围广和准确性高的特点，被广泛采用。通过选择合适的酶底物，如利用E.coli可以产生β-葡萄糖醛酸酶，分解4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)生成具有荧光的4-甲基伞形酮(4-MU)进行检测。具有该代谢途径的大肠杆菌都可以被检出。目前，基于该酶底物法的大肠杆菌检测方法有两种实现方式。一种方式为，国标法(HJ1001-2018)规定的多孔板方法，通过一定条件下，培养到底物充分反应的时间(MUG几乎全部转化为4-MU)，在紫外灯下计数有荧光的格子，然后查表得出样品中大肠杆菌的最大可能数MPN。但是该方法不能区分加入样品时，每个格子中大肠杆菌的数量差异，在反应的终点(一般为24-48h)，可计数的只能是有荧光和无荧光的格子。另一种方式为，基于4-MU的产量与加样时样品中大肠杆菌浓度在一定时间内成线性关系的原理，建立4-MU的发射峰强度与大肠杆菌浓度的关系，从而检测大肠杆菌。该方法可以给出大肠杆菌的具体浓度值，但是由于底物MUG在产物4-MU的发射峰位置也有荧光强度，所以当样品中大肠杆菌含量极少时，产生的4-MU的量很少，产物信号与底物信号不能分开。
技术实现思路
本专利技术要解决现有技术中的技术问题，提供一种用于酶底物法检测大肠杆菌的荧光信号增强方法。r>为了解决上述技术问题，本专利技术的技术方案具体如下：本专利技术提供一种用于酶底物法检测大肠杆菌的荧光信号增强方法，该方法针对的酶底物是4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)；其特征在于，在大肠杆菌与酶底物培养基温育结束之后，测量产物荧光之前，增加一步操作；所述操作为以碱性试剂将溶液调节至pH≥9之后，再测量产物荧光。在上述技术方案中，优选的是：调节溶液pH为9，10，11，或13。在上述技术方案中，所述碱性试剂包括但不局限于NaOH，KOH，氨水等，优选的是：所述碱性试剂为NaOH、KOH、及氨水中的一种或多种。在上述技术方案中，进一步优选的是：所述用于酶底物法检测大肠杆菌的荧光信号增强方法的一种具体实施方式为：步骤1、配制含MUG成分的培养液；步骤2、将纯培养大肠杆菌逐级稀释得到的标准样品或者实际待测样品与步骤1的培养液混合；纯培养大肠杆菌标准样品的具体浓度用平板计数法(CFU)定量；步骤3、将步骤2的培养液于35-44℃温育至产生4-甲基伞形酮；步骤4、将温育结束后的培养液加碱性试剂调节至pH≥9；步骤5、测量荧光强度，366nm激发，读取450nm处的发射峰峰值；步骤6、利用纯培养大肠杆菌标准样品的浓度梯度，及步骤4的发射峰峰值绘制标准曲线；将步骤4中测得的实际待测样品在450nm处的发射峰峰值代入标准曲线，计算得出待测样品中大肠杆菌的浓度。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供一种用于酶底物法检测大肠杆菌的荧光信号增强方法，通过对现有方法增加一步操作，即在大肠杆菌与酶底物培养基温育结束之后，测量产物荧光之前，使用碱性试剂调节溶液至pH≥9，再测量产物荧光；使用碱性试剂调节溶液至pH≥9，可以使产物4-MU的吸收峰明显增强，底物MUG吸收峰变化很小，从而将产物信号与本底信号分开，达到使扣除空白的产物荧光强度差值增强5倍以上，适用于MUG酶底物法检测大肠杆菌，对低浓度大肠杆菌检测效果好。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明。图1为用本专利技术实施例1的检测大肠杆菌的方法检测低浓度大肠杆菌不经过产物信号增强和NaOH调节pH为13条件下的产物信号增强的对比图。图2为用本专利技术实施例2的检测大肠杆菌的方法检测低浓度大肠杆菌不经过产物信号增强和NaOH调节pH为10条件下的产物信号增强的对比图。图3用本专利技术实施例3的检测大肠杆菌的方法检测低浓度大肠杆菌不经过产物信号增强和KOH调节pH为11条件下的产物信号增强的对比图。图4用本专利技术实施例4的检测大肠杆菌的方法检测低浓度大肠杆菌不经过产物信号增强和氨水调节pH为9条件下的产物信号增强的对比图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做以详细说明。实施例1步骤1.购买市售含MUG酶底物培养基，1L培养基含以下试剂成分：4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)75.0mg胰蛋白胨10.0g硫酸铵[(NH4)2SO4]5.0g硫酸锰(MnSO4)0.5mg硫酸锌(ZnSO4)0.5mg硫酸镁(MgSO4)100.0mg氯化钠(NaCl)10.0g氯化钙(CaCl2)50.0mg亚硫酸钠(Na2SO3)40.0mgKH2PO40.9gNa2HPO46.2g步骤2.以无菌操作接种E.coliATCC25922于LB培养基中，培养至稳定期，37℃，220转/分钟条件下大约需要12h。将培养后的E.coli离心清洗3次，定量OD600＝0.2为菌液A，菌液A稀释105为菌液B。接种50μL菌液B，用平板计数法得到30±3CFU大肠杆菌。菌液B稀释十倍后，分别接种17μL，33μL，67μL，134μL于5mL培养基中，空白(B)加入50μL0.9％NaCl溶液。由CFU定量结果计算依次含有大肠杆菌1,2,4,8CFU。步骤3.将步骤2的培养液于37℃温育20h。步骤4.步骤3的溶液每一管均分为两份，其中一份溶液加NaOH调节至pH＝13(标记为pH13)，另一份溶液正常测荧光做对照(标记为Normal)。步骤5.步骤4所述两份溶液测量荧光强度。激发366nm，读取450nm处发射峰峰值。步骤6.结果参见图1：由标记为Normal和pH13的两个溶液荧光测量结果可见，相同浓度样品的扣除空白荧光强度值增加5倍，灵敏度显著提高。实施例2步骤1.购买市售NA-MUG培养基，并按照说明书配制溶液，1L含量：牛肉浸膏3.0g胰蛋白胨5.0gMUG100mg步骤2.同实施例1步骤2所述。步骤3.将步骤2的培养液于44℃温育12h。步骤4.步骤3的溶液每一管均分为两份，其中一份溶液加NaOH调节至pH＝10(标记为pH10)，另一份溶液正常测荧光做对照(标记为Normal)。步骤5.步骤4所述两份溶液测量荧光强度。激发366nm，读取450nm处发射峰峰值。步骤6.结果参见图2：由标记为Normal和pH10的两个溶液荧光测量结果可见，相同浓度样品的扣除空白荧光强度值增加近5倍，灵敏度显著提高。实施例3步骤1.购买市售MMO-MUG培养基，并按照说明书配制溶液，1L含量本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于酶底物法检测大肠杆菌的荧光信号增强方法，其特征在于，该方法针对的酶底物是4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)；/n其特征在于，/n在大肠杆菌与酶底物培养基温育结束之后，测量产物荧光之前，增加一步操作；所述操作为以碱性试剂将溶液调节至pH≥9之后，再测量产物荧光。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于酶底物法检测大肠杆菌的荧光信号增强方法，其特征在于，该方法针对的酶底物是4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)；
其特征在于，
在大肠杆菌与酶底物培养基温育结束之后，测量产物荧光之前，增加一步操作；所述操作为以碱性试剂将溶液调节至pH≥9之后，再测量产物荧光。


2.根据权利要求1所述的用于酶底物法检测大肠杆菌的荧光信号增强方法，其特征在于，调节溶液pH为9，10，11，或13。


3.根据权利要求1所述的用于酶底物法检测大肠杆菌的荧光信号增强方法，其特征在于，所述碱性试剂为NaOH、KOH、及氨水中的一种或多种。


4.根据权利要求1所述的用于酶底物法检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘玲，董绍俊，
申请(专利权)人：中国科学院长春应用化学研究所，
类型：发明
国别省市：吉林;22