一种培养基及其用于检测大肠杆菌的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种培养基及其用于检测大肠杆菌的应用，属于大肠杆菌检测技术领域。本发明专利技术的培养基包括酶底物1为4‑甲基伞形酮‑β‑D‑葡萄糖醛酸苷、营养物2为胰蛋白胨或蛋白胨和贮存液3；所述贮存液3的组成成分为：磷酸盐缓冲溶液：每升含量包括磷酸二氢钾10g、磷酸氢二钾25g、磷酸氢二钠20g和氯化铵2g；硫酸镁溶液11g/L；氯化钙溶液28g/L；氯化铁溶液0.15g/L。本发明专利技术的培养基的贮存液3有利于加速大肠杆菌产生酶分解底物，突出的是针对低浓度大肠杆菌检测能缩短检测时间。贮存液3为独立的盐溶液，在0‑4℃稳定保存6个月以上，方便实现在线监测。本发明专利技术培养基用于检测大肠杆菌的方法，检测结果为大肠杆菌的具体浓度值。

A culture medium and its application in the detection of Escherichia coli

【技术实现步骤摘要】
一种培养基及其用于检测大肠杆菌的应用
本专利技术涉及大肠杆菌检测
，具体涉及一种培养基及其用于检测大肠杆菌的应用。
技术介绍
传统的大肠杆菌(E.coli)检测方法主要包括多管发酵、滤膜法和平板计数法(GB4789.3-2016替代GB/T4789.32-2002)，这些方法都具有操作繁琐、耗时长和灵敏度低的缺点。近年来，科学工作者发展了很多快速检测方法，主要分为三类：分子生物学方法、免疫分析技术和代谢学技术。其中，分子生物学方法是基于遗传物质的检测，准确性有保障。但是该方法需要专业仪器和技术，不能实现在线监测；且检测信号基于遗传物质扩增(PCR等)，检测限一般在102以上。免疫分析技术能够实现快速检测，但是该技术只针对表面抗原、抗体已知菌的检测，如大肠杆菌O157：H7试剂盒，是针对某一血清型大肠杆菌的检测，不能完成水体中所有大肠杆菌的广谱检测。基于代谢学检测的技术能够检测水中大部分类型的大肠杆菌。目前最有效的是利用E.coli产生β-葡萄糖醛酸酶的特点，能分解4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)生成具有荧光的4-甲基伞形酮(4-MU)进行检测，94-97％的大肠杆菌具有该代谢途径。现有技术1已被列入国标法(HJ1001-2018)，该方法使用MinimalMediumONPG-MUG(MMO-MUG)培养基，采用97孔板，计数反应终点时具有荧光的格子(存在大肠杆菌将MUG转化为4-MU的格子)，然后根据有荧光格子的数量查表得出样品中大肠杆菌的最大可能数(MPN)。该方法存在不足为：1、反应时间要大于24h，才能使培养基中MUG绝大部分转化为4-MU，积累到肉眼可见的量；2、每个格子里面含有大肠杆菌的数量差异无法体现，都被记作一个“有荧光的格子”后查表，所以不能得到样品中大肠杆菌的具体浓度值；即该方法给出的结果为最大可能数MPN，不是具体浓度值；3、检出限为10MPN/L，并且因不区分单个格子中大肠杆菌数量，不具备线性。4、配置为溶液后需要立即使用，对于在线监测仪器的运维难以实现。现有技术2申请号为200410051350.7的中国专利申请公开了一种快速测定大肠杆菌的检测方法，该方法将配制好的MUG培养液，分装于试管，接种样品到培养液中，35-44℃下培养6-12h后用荧光分光光度计测定366nm处培养液的荧光强度，根据该条件下荧光强度与菌浓度的对应关系，测得样品中大肠杆菌数。该方法存在不足为：1、低于10个大肠杆菌样品检测时间大约需20-24h；2、配置为溶液后需要立即使用，在实验室操作可以实现，但是对于在线监测仪器的运维难以实现。基于代谢学检测大肠杆菌的培养基组成可归纳为三种成分：酶底物，如MUG等；营养物，如蛋白胨、牛肉膏和酵母浸膏等；盐溶液，目前本领域多沿用MMO-MUG的盐溶液。在这三种成分中，酶底物的作用是指示剂；营养物提供大肠杆菌分裂增生的底物；盐溶液是影响大肠杆菌活性和代谢活性的有效因素。因此，对盐溶液的研究可以加快反应，提升检测速度。
技术实现思路
本专利技术要解决现有技术中的技术问题，提供一种培养基及其用于检测大肠杆菌的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术的技术方案具体如下：本专利技术提供一种培养基，包括：酶底物1、营养物2、和贮存液3；所述酶底物1为4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，缩写MUG)；所述营养物2为胰蛋白胨或蛋白胨；所述贮存液3为盐溶液，其组成成分如下：磷酸盐缓冲溶液：每升含量包括磷酸二氢钾10g、磷酸氢二钾25g、磷酸氢二钠20g和氯化铵2g；硫酸镁溶液，每升含量11g；氯化钙溶液，每升含量28g；氯化铁溶液，每升含量0.15g。在上述技术方案中，优选的是：所述培养基，包括：所述酶底物1为4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷，其质量浓度为0.25-150mg/L；所述营养物2为胰蛋白胨，其质量浓度为0-10g/L；所述贮存液3的各组成成分的用量为0.2-5mL/L。在上述技术方案中，进一步优选的是：所述培养基，包括：所述酶底物1为4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)，其质量浓度为75mg/L；所述营养物2为胰蛋白胨，其质量浓度为10g/L；所述贮存液3的组成成分各1mL/L。在上述技术方案中，优选的是：当检测的实际样品中存在真菌或革兰氏阳性菌时，所述培养基还可以添加两性霉素B(amphotericinB)或茄属植物萃取物(solanum萃取物)或胆盐。在上述技术方案中，进一步优选的是：1L培养基中添加两性霉素B(amphotericinB)1mg，或茄属植物萃取物(solanum萃取物)500mg，或胆盐1.5g。本专利技术提供一种所述培养基用于检测大肠杆菌的应用。使用本专利技术的培养基用于检测大肠杆菌，包括以下步骤：步骤1、按照配方配制培养基。步骤2、以无菌操作接种大肠杆菌于纯培养基中，培养至稳定期，经过系列稀释后用于制备标准曲线。步骤3、将步骤2的菌液用标准平板计数法(CFU)定量得到纯培养大肠杆菌的真实浓度。步骤4、接种步骤2的稀释为系列浓度的各菌液于步骤1制备的培养基中，由步骤3的CFU定量结果计算各菌液中含有大肠杆菌数量；步骤5、接种实际待测样品于步骤1制备的培养基中并添加两性霉素B或茄属植物萃取物或胆盐；步骤6、将步骤4和步骤5的培养基于35-44℃温育6-19h，测量荧光强度，激发366nm，读取450nm处发射峰峰值；步骤7、根据步骤4测得的大肠杆菌数量、及步骤6测得的发射峰峰值，绘制标准曲线；将步骤5和步骤6测得的峰值带入标准曲线，计算得出实际待测样品中大肠杆菌的浓度。在上述技术方案中，优选的是：步骤5中1L培养基中添加两性霉素B(amphotericinB)1mg，或茄属植物萃取物(solanum萃取物)500mg，或胆盐1.5g。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术提供的培养基用于检测大肠杆菌的方法具有以下优点：1)缩短检测时间，突出的是针对低浓度大肠杆菌检测，本专利技术的培养基的贮存液3盐溶液，有利于加速大肠杆菌产生酶分解底物，通过与现有技术对比检测低浓度大肠杆菌提速5小时，实现当天出结果；而现有技术1和2，需要大于24h出检测结果；2)检测结果为大肠杆菌的具体浓度值，而不是最大可能数MPN值；3)灵敏度高，可实现反应体系中低至1个大肠杆菌的检测。2、本专利技术提供的培养基的贮存液3为独立的盐溶液，此溶液可在0-4℃稳定保存6个月以上，方便实现在线监测。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明。图1为使用本专利技术实施例1的培养基与现有技术2的培养基，荧光信号产生对应时间图。图2为本专利技术实施例2的培养基检测大肠杆菌的CFU与荧光强度曲线。图3为本专利技术实施例3的培养基检测大肠杆菌的C本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种培养基，包括：酶底物1、营养物2和贮存液3；/n所述酶底物1为4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)；/n所述营养物2为胰蛋白胨或蛋白胨；/n其特征在于，/n所述贮存液3为盐溶液，其组成成分如下：/n磷酸盐缓冲溶液：每升含量包括磷酸二氢钾10g、磷酸氢二钾25g、磷酸氢二钠20g和氯化铵2g；/n硫酸镁溶液，每升含量11g；/n氯化钙溶液，每升含量28g；/n氯化铁溶液，每升含量0.15g。/n

【技术特征摘要】
1.一种培养基，包括：酶底物1、营养物2和贮存液3；
所述酶底物1为4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)；
所述营养物2为胰蛋白胨或蛋白胨；
其特征在于，
所述贮存液3为盐溶液，其组成成分如下：
磷酸盐缓冲溶液：每升含量包括磷酸二氢钾10g、磷酸氢二钾25g、磷酸氢二钠20g和氯化铵2g；
硫酸镁溶液，每升含量11g；
氯化钙溶液，每升含量28g；
氯化铁溶液，每升含量0.15g。


2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，包括：
所述酶底物1为4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷，其质量浓度为0.25-150mg/L；
所述营养物2为胰蛋白胨，其质量浓度为0-10g/L；
所述贮存液3的各组成成分的用量为0.2-5mL/L。


3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，包括：
所述酶底物1为4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)，其质量浓度为75mg/L；
所述营养物2为胰蛋白胨，其质量浓度为10g/L；
所述贮存液3的组成成分各1mL/L。


4.根据权利要求1-3任意一项所述的培养基，其特征在于，当检测的实际样品中存在真菌或革兰氏阳性菌时，所述培养基还可以添加两性霉素B或茄属植物萃取物或胆盐。


5.根据权利要求4所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘玲，董铭，董绍俊，
申请(专利权)人：中国科学院长春应用化学研究所，
类型：发明
国别省市：吉林;22