PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法技术

本发明专利技术提供了PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，具体包括以下：一、验证PSAP对神经退化变性的影响，具体包括，PSAP对缺乏神经生长因子诱导的感觉神经元退化变性的影响；PSAP对缺乏脑源神经营养因子和神经营养因子‑3诱导的运动神经元退化变性的影响；二、细胞水平验证PSAP在ALS发病机制中的作用；三、动物水平验证PSAP在ALS发病机制中的作用。本发明专利技术为揭示ALS发病机制提供了科学依据，同时也将提供新的治疗ALS的靶标，对人类健康具有深远的科学意义和广阔的市场前景。

The role of PSAP protein in the pathogenesis of ALS and its verification method

【技术实现步骤摘要】
PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法
本专利技术涉及生物
，具体为PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法。
技术介绍
肌萎缩脊髓侧索硬化症(amyotrophiclateralsclerosis，ALS)是一种神经系统退行性疾病，属于罕见病，美国报告ALS的发病率(每年新发病例)为2/10万～4/10万，患病率为4/10万～6/10万。1869年法国神经生物学家Charcot首先描述该病，由于大脑皮质、脑干和脊髓前角的上下运动神经元进行性退化变性，最初导致肌肉无力、萎缩，逐渐瘫痪，并伴随言语、吞咽、呼吸功能障碍，多数病人最终死于呼吸衰竭。流行病学研究表明大约90％-95％ALS病例属于散发性ALS(sporadicALS，sALS)，5％-10％ALS病例属于家族性ALS(familialALS，fALS)，而20％fALS病人存在铜/锌超氧化物歧化酶(Cu/Znsuperoxidedismutase1，SOD1)基因突变。ALS发病后进展迅速，据统计经确诊的病人平均生存期只有18个月，极少数病人存在个体差异，生存期可达十年以上。ALS发病原因十分复杂，研究表明，氧化应激、兴奋性毒性、炎症、缺乏生长因子、细胞凋亡等均能诱发ALS。由于ALS的发病机制尚不明确，目前也没有特效疗法或治疗药物。大量研究结果表明线粒体在ALS疾病中发挥重要的作用，同时死亡受体6(Deathreceptor6，DR6)是治疗ALS疾病的重要靶标，目前发现早老素1相关蛋白(Presenilin1associatedprotein，PSAP)不仅特异性定位于线粒体，而且在DR6诱导的神经细胞退化凋亡中扮演重要的角色，因此，明确PSAP在ALS疾病发病机制中的作用，对于进一步揭示ALS发病机制提供了科学依据，同时也将提供新的治疗ALS的靶标，对人类健康具有深远的科学意义和广阔的市场前景针，对以上所述，在这里提出PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，解决了
技术介绍
中所提出的问题。为解决上述问题，本专利技术提供如下技术方案：PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，具体包括以下：一、验证PSAP对神经退化变性的影响，具体包括，PSAP对缺乏神经生长因子诱导的感觉神经元退化变性的影响；PSAP对缺乏脑源神经营养因子和神经营养因子-3诱导的运动神经元退化变性的影响；二、细胞水平验证PSAP在ALS发病机制中的作用；三、动物水平验证PSAP在ALS发病机制中的作用。进一步地，步骤一的PSAP对缺乏神经生长因子诱导的感觉神经元退化变性的影响具体方法包括以下，选取孕期14.5天野生型和PSAP基因敲除小鼠，取出胚胎，去除胚胎外胞膜，去除头、四肢和内脏，将其余胚胎转移至装有PBS的培养皿中冲洗，生物解剖显微镜下取出脊柱C1-C3区，用灭菌剪刀细细剪碎，连同PBS溶液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min，倒掉上清，加3ml胰酶重悬沉淀，置于37℃水浴中消化20min；20min后，1000rpm离心5min，倒掉上清，加入10mlB27培养基重新悬浮，置于35mm细胞培养皿中，共四组，标记A、B、C、D，其中培养皿A和B为野生型小鼠中提取的细胞，培养皿C和D为PSAP基因敲除小鼠中提取的细胞；放于37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育；第二天加神经生长因子，浓度为50μg/ml，待细胞贴壁良好后，将培养皿B和D中培养基更换为不含神经生长因子的普通B27培养基，于37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育48h后取出，去除培养基，用PBS液体冲洗，4％多聚甲醛固定，利用抗SV2抗体染色，通过免疫荧光实验，镜下观察感觉神经元轴突的变化；预冷的PBS冲洗细胞3次，去除剩余的培养液；4％多聚甲醛室温固定，20min，预冷的PBS冲洗3次；0.3％TritonX-100处理，5min，预冷的PBS冲洗3次；10％山羊血清封闭30min；弃去封闭液，加入10％山羊血清稀释一抗，4℃，过夜；0.1％PBST洗3次，7min/次；加入10％山羊血清稀释荧光标记二抗，室温，2小时；0.1％PBST洗3次后，加入DAPI，5min；0.1％PBST洗3次后，封片，荧光显微镜照相。进一步地，步骤一PSAP对缺乏脑源神经营养因子和神经营养因子-3诱导的运动神经元退化变性的影响，操作包括以下选取孕期14.5天野生型和PSAP-/-小鼠，提取细胞方法如上，分别置于标记A、B、C、D的四个35mm细胞培养皿中，第二天加入脑源神经营养因子，神经营养因子-3，浓度均为10μg/ml，待细胞贴壁良好后，将培养皿B和D中培养基更换为不含神经生长因子的普通B27培养基，于37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育48h后取出，去除培养基，用PBS液体冲洗，4％多聚甲醛固定，利用抗SV2抗体染色，通过免疫荧光实验，镜下观察运动神经元轴索的变化。进一步地，步骤二，选取NSC34细胞，将提纯的质粒pcDNA3.1/LacZ-flag，pcDNA3.1/SOD1-flag以及pcDNA3.1/SOD1G93A-flag转染至细胞，24h后收集样品，通过CCK-8实验检测细胞死亡情况，Westernblot实验检测PARP裂解片段，caspase活化，免疫沉淀实验检测SOD1-PSAP，PSAP-Bax，SOD1-Bax复合物；为研究PSAP的作用，在对照组及实验组细胞中分别转染非靶向性siRNA及PSAP特异性siRNA试剂，将提纯的质粒pcDNA3.1/LacZ-flag，pcDNA3.1/SOD1-flag以及pcDNA3.1/SOD1G93A-flag转染至细胞，检测PARP裂解片段，caspase活化，SOD1-Bax复合物的形成等。进一步地，步骤三包括小鼠饲养及交配繁殖、观测生存时间、记录发病时间、体重监测实验、尼氏染色计数脊柱运动神经元、HE染色检测腿部肌肉变化、小鼠足迹实验、神经肌肉连接NMJ实验、统计学处理。进一步地，小鼠饲养及交配繁殖，转人类SOD1G93A基因小鼠和同窝非转基因小鼠是由购自于美国Jackson实验室的B6SJL-Tg(SOD1G93A)1Gur/J，和已构建的PSAP-/-小鼠，均在恒温22-24℃、恒湿40％-60％、12h光照/黑暗交替循环中饲养，经过交配繁殖后，最终得到实验所需的四个组：野生型小鼠、SOD1G93A转基因小鼠、PSAP-/-和SOD1G93A/PSAP-/-小鼠，按照美国Jackson实验室的实验流程，提取小鼠尾部全基因组DNA，进行PCR验证小鼠的基因型。进一步地，观测生存时间，n＝10，雄鼠，由于SOD1G93A转基因小鼠发病特点，发病末期小鼠极端痛苦，从步态不稳到双下肢出现偏瘫或双侧瘫痪，最终完全瘫痪，不能自主进食，因此应在小鼠失去自理生存能力前将其处死，而死亡判断依本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，其特征在于：具体包括以下：/n一、验证PSAP对神经退化变性的影响，具体包括，PSAP对缺乏神经生长因子诱导的感觉神经元退化变性的影响；PSAP对缺乏脑源神经营养因子和神经营养因子-3诱导的运动神经元退化变性的影响；/n二、细胞水平验证PSAP在ALS发病机制中的作用；/n三、动物水平验证PSAP在ALS发病机制中的作用。/n

【技术特征摘要】
1.PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，其特征在于：具体包括以下：
一、验证PSAP对神经退化变性的影响，具体包括，PSAP对缺乏神经生长因子诱导的感觉神经元退化变性的影响；PSAP对缺乏脑源神经营养因子和神经营养因子-3诱导的运动神经元退化变性的影响；
二、细胞水平验证PSAP在ALS发病机制中的作用；
三、动物水平验证PSAP在ALS发病机制中的作用。


2.根据权利要求1所述的PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，其特征在于：步骤一的PSAP对缺乏神经生长因子诱导的感觉神经元退化变性的影响具体方法包括以下，选取孕期14.5天野生型和PSAP基因敲除小鼠，取出胚胎，去除胚胎外胞膜，去除头、四肢和内脏，将其余胚胎转移至装有PBS的培养皿中冲洗，生物解剖显微镜下取出脊柱C1-C3区，用灭菌剪刀细细剪碎，连同PBS溶液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min，倒掉上清，加3ml胰酶重悬沉淀，置于37℃水浴中消化20min；20min后，1000rpm离心5min，倒掉上清，加入10mlB27培养基重新悬浮，置于35mm细胞培养皿中，共四组，标记A、B、C、D，其中培养皿A和B为野生型小鼠中提取的细胞，培养皿C和D为PSAP基因敲除小鼠中提取的细胞；放于37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育；第二天加神经生长因子，浓度为50μg/ml，待细胞贴壁良好后，将培养皿B和D中培养基更换为不含神经生长因子的普通B27培养基，于37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育48h后取出，去除培养基，用PBS液体冲洗，4％多聚甲醛固定，利用抗SV2抗体染色，通过免疫荧光实验，镜下观察感觉神经元轴突的变化；
预冷的PBS冲洗细胞3次，去除剩余的培养液；
4％多聚甲醛室温固定，20min，预冷的PBS冲洗3次；
0.3％TritonX-100处理，5min，预冷的PBS冲洗3次；
10％山羊血清封闭30min；
弃去封闭液，加入10％山羊血清稀释一抗，4℃，过夜；
0.1％PBST洗3次，7min/次；加入10％山羊血清稀释荧光标记
二抗，室温，2小时；
0.1％PBST洗3次后，加入DAPI，5min；
0.1％PBST洗3次后，封片，荧光显微镜照相。


3.根据权利要求1所述的PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，其特征在于：步骤一PSAP对缺乏脑源神经营养因子和神经营养因子-3诱导的运动神经元退化变性的影响，操作包括以下选取孕期14.5天野生型和PSAP-/-小鼠，提取细胞方法如上，分别置于标记A、B、C、D的四个35mm细胞培养皿中，第二天加入脑源神经营养因子，神经营养因子-3，浓度均为10μg/ml，待细胞贴壁良好后，将培养皿B和D中培养基更换为不含神经生长因子的普通B27培养基，于37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育48h后取出，去除培养基，用PBS液体冲洗，4％多聚甲醛固定，利用抗SV2抗体染色，通过免疫荧光实验，镜下观察运动神经元轴索的变化。


4.根据权利要求1所述的PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，其特征在于：步骤二，选取NSC34细胞，将提纯的质粒pcDNA3.1/LacZ-flag，pcDNA3.1/SOD1-flag以及pcDNA3.1/SOD1G93A-flag转染至细胞，24h后收集样品，通过CCK-8实验检测细胞死亡情况，Westernblot实验检测PARP裂解片段，caspase活化，免疫沉淀实验检测SOD1-PSAP，PSAP-Bax，SOD1-Bax复合物；为研究PSAP的作用，在对照组及实验组细胞中分别转染非靶向性siRNA及PSAP特异性siRNA试剂，将提纯的质粒pcDNA3.1/LacZ-flag，pcDNA3.1/SOD1-flag以及pcDNA3.1/SOD1G93A-flag转染至细胞，检测PARP裂解片段，caspase活化，SOD1-Bax复合物的形成等。


5.根据权利要求1所述的PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，其特征在于：步骤三包括小鼠饲养及交配繁殖、观测生存时间、记录发病时间、体重监测实验、尼氏染色计数脊柱运动神经元、HE染色检测腿部肌肉变化、小鼠足迹实验、神经肌肉连接NMJ实验、统计学处理。


6.根据权利要求5所述的PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，其特征在于：小鼠饲养及交配繁殖，转人类SOD1G93A基因小鼠和同窝非转基因小鼠是由购自于美国Jackson实验室的B6SJL-Tg(SOD1G93A)1Gur/J，和已构建的PSAP-/-小鼠，均在恒温22-24℃、恒湿40％-60％、12h光照/黑暗交替循环中饲养，经过交配繁殖后，最终得到实验所需的四个组：野生型小鼠、SOD1G93A转基因小鼠、PSAP-/-和SOD1G93A/PSAP-/-小鼠，按照美国Jackson实验室的实验流程，提取小鼠尾部全基因组DNA，进行PCR验证小鼠的基因型。


7.根据权利要求5所述的PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，其特征在于：观测生存时间，n＝10，雄鼠，由于SOD1G93A转基因小鼠发病特点，发病末期小鼠极端痛苦，从步态不稳到双下肢出现偏瘫或双侧瘫痪，最终完全瘫痪，不能自主进食，因此应在小鼠失去自理生存能力前将其处死，而死亡判断依据为：将带有SOD1G93A基因的小鼠，即SOD1G93A转基因小鼠和SOD1G93A/PSAP-/-小鼠侧卧放置，若30秒内不能自主翻身至正常状态，则记为死亡，该天即为小鼠的死亡时间，出生日至死亡时间为生存时间。根据这一...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾琳琳，张福强，付学奇，王宇翔，张竞天，牛涵，宋佳玥，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22