一种松材线虫的形态和分子联合检测方法技术

本发明专利技术属于形态和分子联合检测技术领域，公开了一种松材线虫的形态和分子联合检测方法，包括样品的分离、松材线虫的形态学检测、松材线虫的分子检测。本发明专利技术设计了简易的松材线虫分离装置；采用口针的有无对腐生线虫和伞滑刃属线虫进行区分，根据松材线虫和拟松材线虫雌成虫尾部及尾尖突形状差异进行形态鉴定；采用特异PCR技术对伞滑刃属线虫、松材线虫和拟松材线虫进行分子鉴定；设计了完整的检测技术体系细节。本发明专利技术在DNA的提取时对同个松材样品进行3次重复取样，避免了取样时的偶然性检测误差。本发明专利技术满足了林业工作者快速、高效和准确的松材线虫检测需要，为林业部门松材线虫病普查提供了及时、可靠的检测手段与技术保障。

A combined morphological and molecular detection method of pine wood nematode

【技术实现步骤摘要】
一种松材线虫的形态和分子联合检测方法
本专利技术属于形态和分子联合检测
，尤其涉及一种松材线虫的形态和分子联合检测方法。
技术介绍
目前，最接近的现有技术：松材线虫隶属于线虫动物门(Aschelminthes)、线虫纲(Nematoda)、滑刃目(Aphelenchina)、滑刃科(Aphelenchoididae)、伞滑刃属(Bursaphelenchus)，目前伞滑刃属约有80多种。伞滑刃属的线虫多寄生在昆虫体内，和松树死亡有关的种主要是松材线虫和拟松材线虫，松材线虫和拟松材线虫的形态特征非常相似。其主要区别在于雌虫的尾部形态，松材线虫雌成虫尾端宽圆呈指状，尾尖突2微米以下，而拟松材线虫雌成虫尾端较尖细，尾尖突3-5微米。雄虫尾部似鸟爪，向腹面弯曲。松材线虫病多发生在高温干旱的气候条件下，松材线虫雌雄虫交尾后产卵，每只雌虫产卵约100粒。虫卵在25℃下经30小时孵化，幼虫共4龄，在温度30℃时，线虫3天就可以完成一个世代。在我国松材线虫主要通过松墨天牛(Monochamusalternatus)等媒介昆虫传播于松树体，从罹患病本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种松材线虫的形态和分子联合检测方法，其内容包括样品的分离、松材线虫的形态学检测、松材线虫的分子检测、技术操作规范；基于形态特征，采用口针的有无对腐生线虫和伞滑刃属线虫进行区分，根据松材线虫雌虫尾部及尾尖突形状这一相对稳定的特征区别拟松材线虫进行形态鉴定；基于形态鉴定，采用特异PCR技术同时对伞滑刃属线虫、松材线虫和拟松材线虫进行分子鉴定。/n

【技术特征摘要】
1.一种松材线虫的形态和分子联合检测方法，其内容包括样品的分离、松材线虫的形态学检测、松材线虫的分子检测、技术操作规范；基于形态特征，采用口针的有无对腐生线虫和伞滑刃属线虫进行区分，根据松材线虫雌虫尾部及尾尖突形状这一相对稳定的特征区别拟松材线虫进行形态鉴定；基于形态鉴定，采用特异PCR技术同时对伞滑刃属线虫、松材线虫和拟松材线虫进行分子鉴定。


2.如权利要求1所述的松材线虫的形态和分子联合检测方法，其特征在于，所述样品的分离包括以下步骤：
(1)样品的处理：病木样品为圆盘或长条状心材，用利斧将样品削成拇指指节大小的木块，将每个样品收集100～200g，用自封袋装好并贴好标签纸备用；
(2)分离方法：在贝尔曼漏斗法的基础上结合现有的实验设备自主设计的简易分离装置。


3.如权利要求2所述的松材线虫的形态和分子联合检测方法，其特征在于，所述利用简易装置对松材线虫的分离方法如下：
1)置备一个直径10～15cm的玻璃漏斗，玻璃漏斗末端接上一段长15cm的橡胶管，置于自制的漏斗架上，在具橡胶管末端5cm处夹上一个止水夹；在橡胶管末端下方放置一个50ml的小烧杯防止漏斗中液体滴漏；
2)在漏斗内放置定性滤纸并用少量蒸馏水润湿，将100～200g样品放置在漏斗中，并用蒸馏水将样品淹没，并在漏斗外缘贴好样本信息标签；
3)在室温条件下充分浸泡12～24h后，用50ml离心管置于橡胶管下接取20ml的下层液体，并在离心管外贴好标签；
4)将3)分离得到的液体置于冷冻离心机-4℃，5000r/min下离心3min，然后弃上清液，取下层液体分装于3个2ml的离心管中置于高速微量离心机126000r/min中离心30S，弃上清液；
5)在步骤4)得到的3个离心管中，选取2个离心管分别各添加1ml蒸馏水，分别用于形态学检测与分子检测，另1个离心管添加1ml95％的酒精保存于-20℃的冰箱作为标本保存。


4.如权利要求1所述的松材线虫的形态和分子联合检测方法，其特征在于，所述松材线虫的形态学检测方法包括以下步骤：
步骤一，取一干净的载玻片置于光学显微镜载物台上，并在载玻片的中央滴一滴蒸馏水，另取分离样品中蒸馏水保存的一个离心管，用移液枪吸取线虫分离液20ul滴于蒸馏水中；
步骤二，在5.6*10倍光学显微镜下观察是否有松材线虫或疑似松材线虫；若有，则挑取10条制作成临时装片贴好标签，置于高倍显微镜下观察线虫的形态特征是否为松材线虫的形态特征。


5.如权利要求1所述的松材线虫的形态和分子联合检测方法，其特征在于，所述松材线虫的分子检测方法包括：线虫DNA的提取、特异PCR扩增。


6.如权利要求5所述的松材线虫的形态和分子联合检测方法，其特征在于，松材线虫分子检测中，所述线虫DNA的提取包括以下步骤：
1)取一干净的载玻片置于光学显微镜载物台上，并在载玻片的中央滴一滴蒸馏水，另取一管保留在蒸馏水中的样品，用移液枪吸取线虫分离液20ul滴于蒸馏水中；
2)在光学显微镜下挑取3头线虫于2ml的离心管中，用100ul的移液枪加20ul蒸馏水，每个样品做3个重复实验；
3)...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈斌，袁缓，司风玲，闫振天，
申请(专利权)人：重庆师范大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50