用莲类黄酮C-糖基转移酶UGT708N2合成类黄酮C-糖苷的方法技术

本发明专利技术公开了用莲类黄酮C‑糖基转移酶UGT708N2合成类黄酮C‑糖苷的方法。本发明专利技术所提供的制备类黄酮C‑糖苷的方法，是使用如下a)或b)所示的蛋白质催化底物合成类黄酮C‑糖苷：a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与类黄酮C‑糖苷合成相关的由a)衍生的蛋白质。本发明专利技术所提供的类黄酮C‑糖基转移酶UGT708N2是从莲中获得的，体内体外酶活实验证明，UGT708N2能够催化2‑羟基黄烷酮C‑葡萄糖苷生成2‑羟基黄烷酮双‑C‑糖苷，随后通过脱水反应形成黄酮双‑C‑糖苷；本发明专利技术获得的来源于莲的C‑糖基转移酶UGT708N2可用于发酵工程，通过生物转化的方式获得类黄酮C‑糖苷。

Synthesis of flavonoid C-glycosides from Lotus flavonoid c-glycosyltransferase ugt708n2

【技术实现步骤摘要】
用莲类黄酮C-糖基转移酶UGT708N2合成类黄酮C-糖苷的方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及用莲类黄酮C-糖基转移酶UGT708N2合成类黄酮C-糖苷的方法。
技术介绍
类黄酮是广泛存在于植物界的次生代谢产物，由于其诸多健康益处，近年来引起了众多学者的关注。尽管核心骨架只有14个类型，但目前发现的类黄酮及其衍生物已超过9000种。类黄酮的结构多样性源于化学修饰，例如羟基化，甲基化，酰基化，糖基化等。糖基化是最常见的修饰方式，可通过增加化合物的稳定性和溶解性，改变其生物活性，调节其运输和积累，降低其毒性在植物中发挥重要作用。糖通常会通过O-C或C-C键与类黄酮母核连接，从而形成O-糖苷或C-糖苷。与O-糖苷相比，类黄酮C-糖苷由于其独特的化学结构能在一定程度上抵御酸水解和酶降解作用。类黄酮C-糖苷具有丰富的生物学功能，包括抗氧化、抗细菌、抗真菌、紫外线防护等。此外，类黄酮C-糖苷的许多重要药理活性也已得到证实，包括抗炎、抗癌、抗肿瘤、抗糖尿病、抗肥胖、抗病毒、抗高血压以及保护肝脏等。研究表明，荭草苷和异荭草苷具有消炎活性，牡荆苷和异牡荆苷有抗糖尿病活性，夏福塔苷具有保护肝脏的作用(Xiao,J.,Capanoglu,E.,Jassbi,A.R.,andMiron,A.(2016).AdvanceontheflavonoidC-glycosidesandhealthbenefits.Criticalreviewsinfoodscienceandnutrition,56(sup1),S29-S45.)；异夏福塔苷具有降血压的功效(Gomes,A.C.C.,Sampaio,L.D.S.,Silva,P.A.D.,Lamas,M.E.,Sakuragui,C.M.,Junior,C.B.B.,Simas,N.K.,andKuster,R.M.(2014).InvitroeffectofisoschaftosideisolatedfromSyngoniumpodophyllumonpigkidneyNa+,K+-ATPase.QuímicaNova,37(10),1606-1609.)；维采宁-1有抗血小板凝集和防辐射的功效(Kandhare,A.D.,Bodhankar,S.L.,Mohan,V.,andThakurdesai,P.A.(2016).DevelopmentandvalidationofHPLCmethodforvicenin-1isolatedfromfenugreekseedsinratplasma:applicationtopharmacokinetic,tissuedistributionandexcretionstudies.Pharmaceuticalbiology,54(11),2575-2583.)糖基化是类黄酮C-糖苷生物合成途径末端的关键步骤之一。与O-糖苷类似，类黄酮C-糖苷也由尿苷二磷酸-糖依赖的糖基转移酶催化产生。迄今为止，已知的糖基转移酶被分为107个家族，所有UGT均属于GT家族1。通常，UGT的多肽在C末端具有保守区域，由44个氨基酸组成，也称为PSPG-box。该基序与糖的识别和结合有关，并且在动物，植物和微生物中高度保守。前人对植物类黄酮糖基转移酶的研究多集中在O-糖基转移酶上(OGT)。近年来，有少数学者对C-糖基转移酶(CGT)催化的分子机理进行了研究。目前，在植物中类黄酮C-糖苷生物合成途径主要有两条。其中一条是，黄烷酮首先在黄酮合酶的作用下形成黄酮，随后黄酮作为CGT的直接底物形成黄酮C-葡萄糖苷。另一条途径则是，黄烷酮首先在黄烷酮2-羟化酶(F2H)作用下形成2-羟基黄烷酮，随后作为CGT的底物，产生2-羟基黄烷酮C-葡萄糖苷，再通过化学平衡和脱水反应形成黄酮C-葡萄糖苷。目前，类黄酮C-糖苷主要采取从植物中分离纯化的方式得到。然而，从天然产物中分离纯化该类化合物难度较大且成本昂贵，因为天然产物中该类物质往往浓度较低，且杂质化合物难以去除。有研究人员报道了通过化学合成的方式来获取该类物质，但合成步骤十分复杂且产率较低。莲，广泛种植于我国境内，具有重要的观赏价值，食用价值，药用价值，文化价值以及独特宗教意义。根据《中国药典》的记载，莲子可清心安神，交通心肾，涩精止血。前期我们研究发现莲子心中含有丰富的黄酮C-糖苷，但其合成的分子机制尚不明晰。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的主要目的是提供一种通过生物合成制备类黄酮C-糖苷的方法。本专利技术所提供的制备类黄酮C-糖苷的方法，是使用如下a)或b)所示的蛋白质催化底物合成类黄酮C-糖苷：a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与类黄酮C-糖苷合成相关的由a)衍生的蛋白质。所述底物为2-羟基黄烷酮C-葡萄糖苷和UDP-五碳糖。所述2-羟基黄烷酮C-葡萄糖苷为2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷；所述UDP-五碳糖包括UDP-阿拉伯糖和UDP-木糖。所述a)或b)所示的蛋白质催化底物2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷和UDP-阿拉伯糖合成2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷-C-阿拉伯糖苷。所述a)或b)所示的蛋白质催化底物2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷和UDP-木糖合成2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷-C-木糖苷。本专利技术所提供的制备类黄酮C-糖苷的方法，包括如下步骤：(1)将含有序列表中序列3所示核苷酸序列编码基因的重组载体转入工程菌中，得到含有重组载体的工程菌；将所述含有重组载体的工程菌添加至培养基中进行孵育并诱导重组蛋白表达，收集并重悬菌体，得到工程菌液；(2)将底物加入所述步骤(1)得到的工程菌液中，进行孵育，收集上清，目标产物位于上清液中；将所述上清液进行酸化处理，随后洗脱、纯化，即得到类黄酮C-糖苷。所述步骤(1)中的所述重组载体是将含有序列表中序列3所示核苷酸序列的编码基因转入pET28a(+)载体中得到的重组载体；所述工程菌为大肠杆菌Rosetta2(DE3)。所述步骤(2)中的底物为2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷。所述步骤(1)中的孵育是在温度为37℃、转速为200rpm的条件下进行孵育，至OD600为0.5～0.7之间；所述诱导重组蛋白表达是加入终浓度为0.3mM的异丙基1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，置于22℃和150rpm条件下诱导重组蛋白表达；所述重悬菌体是用含2％木糖或阿拉伯糖的M9基本培养基重悬菌体使菌体溶液的吸光值OD600介于3.0～6.0之间。所述步骤(2)中的孵育是将工程菌液置于30℃和150rpm条件下孵育12h，每隔2h向菌液中添加浓度为200μM的底物；所述洗脱是利用20-60％甲醇水进行线性梯度洗脱。本专利技术所提供的类黄酮C-糖基转移酶是从莲中获得的，属于UGT家族。体内体外酶活实验证明，UGT708N2能够催化2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷生成2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷-C-阿拉伯糖苷或2-羟本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备类黄酮C-糖苷的方法，其特征在于：使用如下a)或b)所示的蛋白质催化底物合成类黄酮C-糖苷：/na)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；/nb)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与类黄酮C-糖苷合成相关的由a)衍生的蛋白质。/n

【技术特征摘要】
1.一种制备类黄酮C-糖苷的方法，其特征在于：使用如下a)或b)所示的蛋白质催化底物合成类黄酮C-糖苷：
a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与类黄酮C-糖苷合成相关的由a)衍生的蛋白质。


2.根据权利要求1所述的制备类黄酮C-糖苷的方法，其特征在于：所述底物为2-羟基黄烷酮C-葡萄糖苷和UDP-五碳糖。


3.根据权利要求2所述的制备类黄酮C-糖苷的方法，其特征在于：所述2-羟基黄烷酮C-葡萄糖苷为2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷；所述UDP-五碳糖包括UDP-阿拉伯糖和UDP-木糖。


4.根据权利要求2所述的制备类黄酮C-糖苷的方法，其特征在于：所述a)或b)所示的蛋白质催化底物2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷和UDP-阿拉伯糖合成2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷-C-阿拉伯糖苷。


5.根据权利要求2所述的制备类黄酮C-糖苷的方法，其特征在于：所述a)或b)所示的蛋白质催化底物2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷和UDP-木糖合成2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷-C-木糖苷。


6.一种制备类黄酮C-糖苷的方法，包括如下步骤：
(1)将含有序列表中序列3所示核苷酸序列编码基因的重组载体转入工程菌中，得到含有重组载体的工程菌；将所述含有重组载体的工程菌添加至培养基中进行孵育并诱导...

【专利技术属性】
技术研发人员：王亮生，冯成庸，李珊珊，吴倩，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11