具有抗真菌和清除自由基活性的环色-丝-缬-缬-亮肽及制备方法技术

本发明专利技术涉及具有抗真菌和清除自由基活性的环色‑丝‑缬‑缬‑亮肽（Trp‑Ser‑Val‑Val‑Leu环肽）及制备方法，属于生物制品的提取制备技术领域。所述环色‑丝‑缬‑缬‑亮肽是由色氨酸、丝氨酸、缬氨酸、缬氨酸和亮氨酸，以酰胺键连接而成的十五元环状五肽。这是一个新型化合物，尚无文献报道。本发明专利技术化合物可通过培养蛙粪霉，然后提取分离得到。环色‑丝‑缬‑缬‑亮肽纯品为白色粉末，对DPPH自由基的半数清除浓度（DC

Cyclochrome silk valerian valerian brilliant peptide with antifungal and free radical scavenging activity and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
具有抗真菌和清除自由基活性的环色-丝-缬-缬-亮肽及制备方法
本专利技术属于生物制品的提取制备
，涉及具有抗真菌和自由基清除活性的环色-丝-缬-缬-亮肽（Trp-Ser-Val-Val-Leu环肽）提取和纯化。
技术介绍
环色-丝-缬-缬-亮肽是从一种蛙粪霉(Basidiobolussp.)培养物中分离制备得到的具有抗真菌和清除自由基活性的生物活性物质。蛙粪霉(Basidiobolussp.)为虫霉目蛙粪霉科蛙粪霉属的真菌；在我国常见的有蛙生蛙粪霉、固孢蛙粪霉和裂孢蛙粪霉等。上述菌种可从土壤和两栖类动物粪便中分离得到。抗真菌活性：有多种真菌是条件致病菌，当人们抵抗力下降时容易感染，特别是老人和病人容易发生真菌感染。目前世界老龄化日趋严重，同时由于环境污染等因素，人们的抵抗力呈下降趋势，真菌感染病例呈上升趋势，同时早期抗真菌药已出现耐药现象，因此开发新型抗真菌活性物质非常有意义。清除自由基活性：自由基（freeradical），从化学结构上看是指含未配对电子的基团、原子或分子。自由基具有高度化学活性。对于生命体来说，自由基是生命活动中多种生化反应的中间产物。在正常情况下，人体内的自由基是处于产生与清除的动态平衡之中。自由基是机体有效的防御系统，如不能维持一定水平的自由基则会对机体生命活动带来不利影响。但自由基产生过多或清除过慢，它通过攻击生命大分子物质及各种细胞器，会造成机体分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老进程并诱发各种疾病。最新的研究表明，人类的衰老及许多疾病都与自由基损伤有关。具有清除自由基活性的物质能与自由基反应并使之还原成非自由基化合物，可清除机体代谢过程中产生的过多的自由基，是一种可增进人体健康的重要活性物质。自由基清除剂在非生命体系中有抗氧化作用，能够有效地阻止物质的氧化败坏，对于延长物品的保质期有着重要作用，被广泛用于食品、药品、日用化学品等中。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供具有抗真菌和清除自由基活性的环色-丝-缬-缬-亮肽及制备方法。为寻找新型天然高效的具有抗真菌活性和清除自由基活性的物质，专利技术人通过对中国的100余株昆虫病原真菌代谢物进行活性研究，发现了从一种蛙粪霉中提取的环色-丝-缬-缬-亮肽具有很强的抗白色链珠菌活性和清除自由基活性的作用。具有抗真菌和清除自由基活性的环色-丝-缬-缬-亮肽的结构式如下：所述环色-丝-缬-缬-亮肽是由色氨酸、丝氨酸、缬氨酸、缬氨酸和亮氨酸，以酰胺键连接而成的十五元环状五肽；所述环色-丝-缬-缬-亮肽具有清除自由基活性和抗白色链珠菌活性；对二苯基苦基苯肼自由基（DPPH）的半数清除浓度（DC50）为：1.17mg/mL，在200μg/mL的浓度下对白色链珠菌的抑菌圈直径为14.62mm。具有抗真菌和清除自由基活性的环色-丝-缬-缬-亮肽的制备操作步骤如下：（1）菌种培养将蛙粪霉（Basidiobolussp.）经过斜面菌种培养、二级液体种子培养、三级液体种子培养和四级培养，得到液体的最终发酵物或固体的最终发酵物；所述蛙粪霉（Basidiobolussp.）为蛙生蛙粪霉、固孢蛙粪霉或裂孢蛙粪霉中的一种。（2）最终发酵物中有效成分的提取和精制用甲醇或乙醇提取最终发酵物中的有效成分，采用反相色谱方法纯化，得到白色粉末状的环色-丝-缬-缬-亮肽。进一步限定的制备技术方案如下：所述步骤（1）的具体操作如下：（1.1）斜面种子培养将蛙粪霉菌株接种于土豆琼脂（PDA）斜面培养基，于25～36℃恒温、培养4～8d，得到一级菌种；（1.2）二级液体种子培养将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；在大于等于100ml三角瓶中加入30～50%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种1～3支斜面菌种，在全温振荡培养箱中，温度25～36℃、转速150～250rpm条件下，培养3～7d，即得到二级菌种；液体摇瓶培养基由葡萄糖25.0～50.0g/L、麦芽提取物10.0～30.0g/L、蛋白胨2.0～6.0g/L、酵母浸出粉1.0～4.0g/L、氯化钾（KCl2）0.3～2.0g/L、七水硫酸镁（MgSO4.7H2O）0.3～2.0g/L、磷酸二氢钾（KH2PO4）0.3～2.0g/L；（1.3）三级液体种子培养将二级菌种接种到大于等于5L的发酵罐，装液量为罐体积的50～80%，接种量3～10%，在通气量按体积比1:1～2（v/v）、压力0.1～0.2MP、25～36℃条件下，恒温通气培养2～5天，得到三级菌种；发酵罐中的培养基同步骤（1.2）中的液体培养基；（1.4）四级培养四级培养为液体培养，将三级菌种接种到大于等于50L的发酵罐，装液量为罐体积的50～80%，接种量3～10%，在通气量按体积比1:1～2（v/v）、压力0.1～0.2MP、25～36℃条件下，恒温通气培养5～15天，得到液体的最终发酵物；发酵罐中的培养基步骤（1.2）中的液体培养基。所述步骤（1.4）中，四级培养为固体培养，将三级液体菌种拌入固体培养基中，接种量为固体料量的3～10%，25～36℃恒温培养5～15天，得到固体的最终发酵物；所述固体培养基由葡萄糖25.0～50.0g/L、麦芽提取物10.0～30.0g/L、蛋白胨2.0～6.0g/L、酵母浸出粉1.0～4.0g/L、氯化钾（KCl2）0.3～2.0g/L、七水硫酸镁（MgSO4.7H2O）0.3～2.0g/L、磷酸二氢钾（KH2PO4）0.3～2.0g/L、琼脂15.0～30.0g/L和水混合均匀制成。所述步骤（2）的具体操作如下：（2.1）最终发酵物的预处理将液体的最终发酵物经0.20～1.0μm滤膜过滤或2000-12000转/分钟条件下离心得到菌丝体；将菌丝体冷冻干燥，粉碎，得到过20～120目筛的预处理物；或，将固体的最终发酵物在30～130℃干燥到含水率小于等于20%，然后粉碎到20～120目的预处理物；（2.2）预处理物中有效成分的提取和分离纯化（2.2.1）提取将预处理物用甲醇或乙醇提取；料液比为1:2～20（W:V）、超声波功率10～100KHz,提取时间为10～200分钟；在转速大于等于2000转/分钟条件下离心，或0.20～1.0μm滤膜过滤；取滤液或离心上清，在温度小于等于100℃浓缩到原体积的1/2～1/10，得到浓缩脱醇液，同时回收甲醇或乙醇，浓缩脱醇液用于进一步的色谱法精制；（2.2.2）分离纯化采用反相色谱方法纯化，固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即RPC18，颗粒直径为3～50微米；用甲醇和水按0～100：100～0配比进行梯度洗脱，收集质谱检测器上分子量为676的色谱流份；将收集物在小于等于100℃温度以下浓缩到粘稠状，在低于170℃条件下干燥；得到白色粉末状的环色-丝-缬-缬-亮肽。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.具有抗真菌和清除自由基活性的环色-丝-缬-缬-亮肽，其特征在于：所述环色-丝-缬-缬-亮肽的结构式如下：/n

【技术特征摘要】
1.具有抗真菌和清除自由基活性的环色-丝-缬-缬-亮肽，其特征在于：所述环色-丝-缬-缬-亮肽的结构式如下：



所述环色-丝-缬-缬-亮肽是由色氨酸、丝氨酸、缬氨酸、缬氨酸和亮氨酸，以酰胺键连接而成的十五元环状五肽；
所述环色-丝-缬-缬-亮肽具有清除自由基活性和抗白色链珠菌活性；
对二苯基苦基苯肼自由基（DPPH）的半数清除浓度（DC50）为：1.17mg/mL，在200μg/mL的浓度下对白色链珠菌的抑菌圈直径为14.62mm。


2.权利要求1所述具有抗真菌和清除自由基活性的环色-丝-缬-缬-亮肽的制备方法，其特征在于操作步骤如下：
（1）菌种培养
将蛙粪霉（Basidiobolussp.）经过斜面菌种培养、二级液体种子培养、三级液体种子培养和四级培养，得到液体的最终发酵物或固体的最终发酵物；
所述蛙粪霉（Basidiobolussp.）为蛙生蛙粪霉、固孢蛙粪霉或裂孢蛙粪霉中的一种；
（2）最终发酵物中有效成分的提取和精制
用甲醇或乙醇提取最终发酵物中的有效成分，采用反相色谱方法纯化，得到白色粉末状的环色-丝-缬-缬-亮肽。


3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于所述步骤（1）的具体操作如下：
（1.1）斜面种子培养
将蛙粪霉菌株接种于土豆琼脂（PDA）斜面培养基，于25～36℃恒温、培养4～8d，得到一级菌种；
（1.2）二级液体种子培养
将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；
在大于等于100ml三角瓶中加入30～50%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种1～3支斜面菌种，在全温振荡培养箱中，温度25～36℃、转速150～250rpm条件下，培养3～7d，即得到二级菌种；
液体摇瓶培养基由葡萄糖25.0～50.0g/L、麦芽提取物10.0～30.0g/L、蛋白胨2.0～6.0g/L、酵母浸出粉1.0～4.0g/L、氯化钾（KCl2）0.3～2.0g/L、七水硫酸镁（MgSO4.7H2O）0.3～2.0g/L、磷酸二氢钾（KH2PO4）0.3～2.0g/L；
（1.3）三级液体种子培养
将二级菌种接种到大于等于5L的发酵罐，装液量为罐体积的50～80%，接种量3～10%，在通气量按体积比1:1～2（v/v）、压力0.1～0.2MP、25～36℃条件下，恒温通气培养2～5天，得到三级菌种；
发酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡丰林，罗飞飞，何亚琼，尉杰，赵铖，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34