【技术实现步骤摘要】
一种测量肉葡萄球菌表面展示EGFP荧光强度的方法
本专利技术属于生物
，特别细菌表面展示技术，是一种检测异源蛋白在葡萄球菌表面展示表达的方法。
技术介绍
葡萄球菌(Staphylococcus)是一群革兰氏阳性球菌，因常常堆聚成葡萄串状而得名，无鞭毛，不能运动，也无芽孢。肉葡萄球菌不产生任何毒素、溶血素、凝固酶或聚集因子，是目前葡萄球菌属中被完全确认的食品级GRAS(generallyrecognizedassafe)菌株。肉葡萄球菌(S.carnosus)作为肉制品发酵行业中形成肉制品风味的关键菌种，在欧洲等地被用作生肉产品起始培养物已经超过60年。此外，由于肉葡萄球菌具有很低的胞外蛋白水解活性，所以肉葡萄球菌还可以用作良好的基因工程宿主菌。作为选择性的克隆宿主菌，不仅可以在分子遗传学方面用来研究葡萄球菌属相关代谢途径，而且还能用于异源蛋白的表达和分泌。许多在细胞质内合成的蛋白质可以从细胞质传递到细胞膜、周质空间或分泌到细胞外，这种类型的蛋白质被称为分泌型蛋白质，其传递至细胞外的过程被称为蛋白质的跨膜转运。分...
【技术保护点】
1.一种用液氮研磨破壁释放具有活性的包含EGFP的嵌合体蛋白并使其溶于PBS缓冲液中，再使用荧光分光光度计测量其荧光强度，其结果可以说明成功展示在肉葡萄球菌细胞壁的蛋白具有活性，以此来观察细胞表面展示效率。其特征在于按如下步骤进行：/n(1)构建锚定体系的质粒；/n(2)用热激法将(1)中构建的质粒转入大肠杆菌DH5α宿主中培养；/n(3)提取质粒，电转化法转入肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)TM300宿主中培养；/n(4)用正置荧光显微镜筛选正确的肉葡萄球菌转化子；/n(5)培养正确表达的转化子，收集发酵液，离心，分别收集上清液和菌体；/n(6...
【技术特征摘要】
1.一种用液氮研磨破壁释放具有活性的包含EGFP的嵌合体蛋白并使其溶于PBS缓冲液中，再使用荧光分光光度计测量其荧光强度，其结果可以说明成功展示在肉葡萄球菌细胞壁的蛋白具有活性，以此来观察细胞表面展示效率。其特征在于按如下步骤进行：
(1)构建锚定体系的质粒；
(2)用热激法将(1)中构建的质粒转入大肠杆菌DH5α宿主中培养；
(3)提取质粒，电转化法转入肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)TM300宿主中培养；
(4)用正置荧光显微镜筛选正确的肉葡萄球菌转化子；
(5)培养正确表达的转化子，收集发酵液，离心，分别收集上清液和菌体；
(6)菌体放置-80℃冰箱保存，上清液可直接用荧光分光光度计测量荧光强度；
(7)将冰冻的菌体收集到研钵，用液氮将其研磨至粉末，用PBS缓冲液溶解粉末；
(8)离心，收集上清液；
(9)含有溶解蛋白的上清液稀释不同的倍数，用荧光分光光度计测量，得到一个最合适的稀释倍数，观察在不同锚定体系下表面展示蛋白的展示效率。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述步骤(1)中质粒构建方法为：以质粒pBT2-ET-EGFP为基础，合成表面展示所用的信号肽和原肽DNA序列(Signal-Pro-Peptide，SPP；或Pre-Pro-peptide)，替换原质粒的Tat信号肽。合成两种锚定DNA序列XM和FibronectinBindingProtein(FnBPB)，并分别连接在EGFP基因之后，合成清蛋白结合蛋白Albumin-BindingProtein(ABP)基因，分别加在XM和FnBPB之前。构建成功分别含有4个不同锚定体系的质粒，测序确认开放阅读框正确。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述步骤(2)中将构建成功的4个质粒分别用热激法(化学转化法)转入大肠杆菌。取1μl质粒加入DH5α感受态，冰浴30min，在42℃水浴锅中热激90s，再在冰上冰浴3min，将600μlLB培养基加入转化混合物中，在37℃、180rpm条件下孵育45min，取200μl孵育液涂在氨苄青霉素(Amp)抗性的LB固体培养...
【专利技术属性】
技术研发人员：高强，谭新琦，安娅，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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