用于von Willebrand因子的病毒过滤的方法技术

本发明专利技术涉及一种过滤包含von Willebrand因子(VWF)的溶液的方法，所述方法包括(a)提供包含VWF和碱性氨基酸的溶液；和(b)使所述步骤(a)的溶液经历通过孔径小于或等于35nm的过滤器的病毒过滤。

A method of virus filtering for von Willebrand factor

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于vonWillebrand因子的病毒过滤的方法本专利技术涉及一种过滤包含vonWillebrand因子(VWF)的溶液的方法，所述方法包括(a)提供包含VWF和碱性氨基酸的溶液；和(b)使步骤(a)的溶液经历通过孔径小于或等于35nm的过滤器(filter)的病毒过滤。
技术介绍
存在由凝血因子缺乏引起的各种出血障碍。最常见的障碍是分别由凝血因子VIII(FVIII)和IX缺乏引起的血友病A和B。另一种已知的出血障碍是vonWillebrand病(VWD)。在血浆中，FVIII主要以与vonWillebrand因子(VWF)的非共价复合物形式存在，其凝血功能是促进依赖于因子IXa的因子X向Xa的转化。VWF(在不同形式的vonWillebrand病(VWD)中是缺失的、功能缺陷的或仅以减少量而可获得)是存在于哺乳动物血浆中的一种多聚体粘附糖蛋白，具有多种生理功能。在初次止血过程中，VWF充当血小板表面特定受体与细胞外基质成分(如胶原蛋白)之间的介体。此外，VWF充当前凝血素FVIII的载体和稳定蛋白。VWF作为2813个氨基酸的前体分子在内皮细胞和巨核细胞中合成。前体多肽、pre-pro-VWF由以下组成：N-末端的22个残基信号肽，随后是741-残基前肽和2050-残基的多肽，其被发现在成熟血浆VWF中(Fischer等，FEBSLett351：345-348，1994)。在内质网状组织中的信号肽裂解后，在VWF的两个单体之间形成了C端二硫键。在通过分泌途径的进一步运输过程中，添加了12个N-连接和10个O-连接的碳水化合物侧链。更重要的是，在晚期高尔基体中，VWF二聚体通过N-末端二硫键(bridges)进行多聚，并且长741个氨基酸的前肽被酶PACE/弗林蛋白酶切割掉。一旦被分泌到血浆中，蛋白酶ADAMTS13可以在VWF的A1结构域内裂解高分子量VWF多聚体。因此血浆VWF由全范围多聚体组成，范围从500kDa的单二聚体到由至多超过20个分子量超过10,000kDa的二聚体组成的多聚体。从而VWF高分子量多聚体(HMWM)具有最强的止血活性，这可以通过利托菌素辅因子活性(VWF:RCo)进行测量。VWF:RCo/VWF抗原的比率越高，高分子量多聚体的相对量越高。例如在US5854403，EP0411810A1，EP0639203或RistolP.等人，Sangre(1996)41：125-130中描述了多种纯化VWF或FVIII/VWF复合物的方法。VWF的纯化需要用于去除潜在存在的病原体(例如病毒)的一个或多个步骤。一种对消除病毒非常有效的方法是通过孔径能够阻止病毒颗粒的过滤器进行过滤(病毒过滤)。该方法的功效取决于所用过滤器的孔径。存在具有不同的孔径、通常在15到75纳米(nm)之间的纳米过滤器，较小的孔径在保留病原体方面产生更好的效果。孔径小于35nm，优选在15到20nm之间的纳米过滤器能够去除甚至很小的病毒，例如红病毒属B19或甲型肝炎病毒。但是如果高分子量的蛋白质也应通过过滤器，则通过具有小孔径的纳米过滤器进行过滤是有问题的(WO2005/040214A1)。通常，VWF或FVIII/VWF复合物似乎不适合通过孔径小于35nm的纳米过滤器进行有效过滤，特别是如果VWF溶液包含较高分子量VWF的多聚体形式(EP1632501)。EP1348445A1描述了一种通过纳米过滤从包含纤维蛋白原的溶液中分离病毒的方法，其中在纳米过滤之前将促溶剂添加到纤维蛋白原溶液中。然而，EP1348445A1没有提及VWF。EP2078730A1描述了一种方法，其中如果存在钙离子，可以通过标称孔径小于35nm甚至20nm的纳米过滤器过滤含有VWF或FVIII/VWF复合物的溶液(请参阅EP2078730A1的第[0033]段)。WO2015/188224A1描述了一种制备重组VWF的方法，所述方法包括将VWF的多聚体分离成富含VWF的低分子量多聚体的渗透物级分和富含VWF的HMWM的渗透物级分。然而，过滤器的孔径相对较大(0.05μm至1μm)。就滤液中VWF的收率而言，现有技术的方法仍不能令人满意。因此，持续需要用于VWF病毒过滤的改进方法，特别是提供VWF的良好收率的方法。
技术实现思路
本申请的专利技术人发现，如果在至少150mM精氨酸的存在下进行病毒过滤，则在对VWF溶液进行病毒过滤时，在滤液中可获得令人惊讶的高收率的VWF抗原和VWF活性。进一步发现，用赖氨酸和组氨酸获得相似的结果。因此，本专利技术尤其涉及在下文的项[1]至[64]中定义的方面和实施方案。[1]过滤包含vonWillebrand因子(VWF)的溶液的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含VWF和至少一种浓度为至少150mM的碱性氨基酸的溶液；(b)使步骤(a)的溶液经历通过孔径小于或等于35nm的过滤器的病毒过滤。[2]项[1]的方法，其中在步骤(a)的溶液中的所述VWF包含VWF的高分子量多聚体(HMWM)。[3]根据项[1]或[2]的方法，其中步骤(b)中的病毒过滤期间的压力低于0.5巴。[4]项[3]的方法，其中步骤(b)中的病毒过滤期间的压力为0.1至0.4巴。[5]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液的pH为5.0至9.0。[6]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液的pH为6.0至8.0。[7]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液的pH为6.5至7.5。[8]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(b)中的病毒过滤在15至30℃之间的温度下进行。[9]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(b)中的病毒过滤在18至28℃之间的温度下进行。[10]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度为至少300mM。[11]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度为至少350mM。[12]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度为至少400mM。[13]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度为至少450mM。[14]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度为至少500mM。[15]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度小于1000mM。[16]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度小于900mM。[17]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度小于800mM。[18]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度小于750mM。[1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.过滤包含von Willebrand因子(VWF)的溶液的方法，所述方法包括以下步骤：/n(a)提供包含VWF和至少一种碱性氨基酸的溶液，其中所述溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度为至少150mM；/n(b)使所述步骤(a)的溶液经历通过孔径小于或等于35nm的过滤器的病毒过滤。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170823 EP 17187436.51.过滤包含vonWillebrand因子(VWF)的溶液的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含VWF和至少一种碱性氨基酸的溶液，其中所述溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度为至少150mM；
(b)使所述步骤(a)的溶液经历通过孔径小于或等于35nm的过滤器的病毒过滤。


2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)的溶液中的所述VWF包括VWF的高分子量多聚体(HMWM)。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述步骤(b)中的病毒过滤期间的压力低于0.5巴。


4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述步骤(a)中提供的溶液的pH为5.0至9.0，特别是6.0至8.0。


5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述步骤(b)中的病毒过滤是在15至30℃，特别是18至28℃的温度下进行的。


6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度为至少300mM、至少350mM、至少400mM、至少450mM或至少500mM。


7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度小于1,000mM、小于950mM、小于900mM、小于850mM、小于800mM或小于750mM。


8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述步骤(a)中提供的溶液还包含浓度为至少50mM、至少100mM、至少200mM、至少300mM或至少350mM的钙离子。


9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤器的孔径小于或等于25nm或小于或等于20nm。


10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述过滤器的孔径为13nm至35nm、13nm至25nm、18nm至22nm或13nm至17nm。

【专利技术属性】
技术研发人员：T·诺瓦克，H·林德，
申请(专利权)人：德国杰特贝林生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE