用于纯化C1-INH的方法技术

本发明专利技术涉及用于纯化C1‑酯酶抑制剂(C1‑INH)，且更特别的C1‑INH浓缩物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于纯化C1-INH的方法本专利技术涉及用于纯化C1-酯酶抑制剂(C1-INH)，且更特别的C1-INH浓缩物的方法。C1-INH(补体激活途径的蛋白质)是存在于血浆中蛋白酶的抑制剂，其通过与活化的C1r和C1s形成共价复合物来控制C1-活化。它还“控制”重要的凝血酶，诸如血浆前激肽释放酶，因子XI和XII，以及纤维蛋白溶酶。C1-INH缺乏(deficiency)例如与遗传性血管性水肿(HAE)有关，所述遗传性血管性水肿(HAE)是由缺乏C1-INH(I型HAE)或C1-INH活性降低(II型HAE)引起的。C1-INH缺乏也可能是由C1-INH的消耗引起的(所述C1-INH的消耗是由于当诸如在心肺机中血液接触表面时产生的酶的中和)，以及在引发凝血级联的疾病过程中，诸如出现在慢性、特别是风湿性障碍的情况下的免疫复合物。当前，在预防或治疗急性HAE中必须将C1-INH蛋白替代视为金标准。对于市售的人血浆衍生的C1-INH特别是如此，据报道其具有比在转基因兔中生产的与人C1-INH蛋白不相同的市售重组C1-INH更自然的功能(Feussner等人,Transfusion2014Oct；54(10):2566-73)。已经考虑的其他治疗应用包括C1-INH在预防，降低和/或治疗缺血再灌注损伤中的用途(参见WO2007/073186)。从人血浆中分离和/或纯化C1-INH是已知的，但是或多或少是昂贵的，并且特别是最经常是非常耗时的方法。许多现有技术的方法(诸如例如在Haupt等人,Eur.J.Biochem.1970；17:254-261；Reboul等人,FEBSLetters1977；79(1):45-50中描述的方法)太复杂，与收率不足有关，和/或花费太长时间以致不能适应技术规模。其他现有技术方法(诸如例如Vogelaar等人.VoxSang1974；26:118-127描述的方法)具有其他缺点。提出的用于从血浆中产生C1-INH的不同方法包括各种分离方法，诸如亲和色谱法，阳离子交换色谱法，阴离子交换色谱法，凝胶过滤，沉淀和疏水相互作用色谱法。单独使用这些方法中的任一种通常不足以充分地纯化C1-INH，且特别是C1-INH浓缩物，因此在现有技术中已经提出了它们的各种组合。EP0698616B描述了使用阴离子交换色谱法，接着是阳离子交换色谱法。EP0101935B描述了沉淀步骤和以负模式的疏水相互作用色谱法的组合，以约20％的收率得到90％纯的C1-INH制备物(preparation)。US5030578描述了PEG沉淀和穿过木菠萝凝集素(jacalin)-琼脂糖的色谱法以及以负模式的疏水相互作用色谱法。WO01/46219描述了涉及第一和第二阴离子交换的方法。如今，有四种市售的C1-INH浓缩物用于治疗血管性水肿，其中三种是血浆衍生的。这些血浆衍生的C1-INH浓缩物中的一种以商标出售。这些C1-INH浓缩物是根据不同的专有方法制备的，其中制备的方法涉及疏水相互作用色谱法(HIC)的步骤，但以负模式进行(参见在Feussner等人,Transfusion2014Oct；54(10):2566-73中)。更一般地说，HIC基于分子的疏水性分离分子，并且被用于纯化蛋白质，同时保持生物活性。在高盐缓冲液中，将分子(且特别是除去(disposingof)疏水和亲水区域的蛋白质)应用到HIC柱上。缓冲液中的盐降低样品溶质的溶剂化。随着溶剂化的减少，变得暴露的疏水区域被介质吸附，或被固定相保留和/或被结合到固定相。分子越疏水，促进结合所需的盐就越少。然后通常使用递减的盐梯度从柱中洗脱样品，以便增加疏水性。关于分子通过首先将分子结合到固定相然后洗脱它以使用HIC的这种模式在下文中将被称为“正模式”。然而，在C1-INH的特定情况下，尚未以这种方式使用HIC，即，未以“正”或“结合”模式使用HIC。这是因为在C1-INH的情况下，已经描述了HIC利用C1-INH的显著亲水性。其中其他蛋白质被保留在(疏水)柱上，而C1-INH被保留在流动相中。在下文中，使用HIC纯化C1-INH的这种现有技术将被称为“负”或“流动通过(flowthrough)”模式。以流动通过模式的HIC是现有技术如何使用HIC用于纯化C1-INH。专利技术人不知道以不同方式使用HIC用于纯化C1-INH的任何描述。例如，流动通过被描述为EP0101935的专利技术的核心。US5030578也描述了在C1-INH不被柱保留(流动通过模式)的条件下的HIC，参考Nilsson和Wiman,BiochimicaetBiophysicaActa1982；705(2):271-276在该上下文中也描述了以流动通过模式的HIC。且最近，Kumar等人,J.BioprocesBiotech2014；4(6)(DOI:10.4172/2155-9821.1000174)也描述了C1-INH的中间纯化步骤，其涉及以流动通过或负模式的HIC：作者认为0.8M硫酸铵浓度是在流动通过级分中得到纯化的C1-INH并将它从其他血浆蛋白中分离的最佳条件。如此获得的C1-INH浓缩物需要进一步纯化。根据上述现有技术，可以以不同的方式获得用于HIC纯化C1-INH的起始物料(startingmaterial)，涉及诸如低温沉淀，离子交换色谱法，分步沉淀和/或其组合的步骤，其中已知分步沉淀被用在技术或工业规模上，即在的制备中(其中硫酸铵沉淀在HIC之前，参见Feussner等人,Transfusion2014Oct；54(10):2566-73)。根据EP0101935，使用液体硫酸铵作为沉淀剂进行分步沉淀，直到溶液包含60％硫酸铵。此后，将沉淀的C1-INH用含有沉淀剂(在这种情况下为硫酸铵)的水溶液以C1-INH不沉淀的浓度溶解。尽管此方法已经达到技术规模，但是它仍需要重要的资源，例如：以时间、空间和物质的形式。人血浆通常难以实现以足够的量来满足现存需求。因此，最重要的是实现用更有效，且特别是耗时更少的方法，以帮助确保其最佳使用。因此，本专利技术旨在提供使用疏水相互作用色谱法用于纯化C1-INH的更有效且耗时更少的方法。通过使用疏水相互作用色谱法(HIC)用于纯化C1-INH的方法解决了上述问题，该方法包括以下步骤：(i)在其中C1-INH结合到固定相的第一条件下，将含有溶解在其中的C1-INH的溶液装载在包含固定相的疏水作用色谱柱上，(ii)应用第二条件，以便借助于流动相洗脱C1-INH。鉴于现有技术，相当令人惊讶地是，专利技术人已经发现，在HIC中将C1-INH结合到固定相能够节约相当大量的时间和物质。首先，以正或结合模式使用的HIC柱可能以比流动通过或负模式使用以纯化C1-INH的实质上相同体积的HIC柱实质上更大量装载含有C1-INH的起始物料(专利技术人发现多达约4倍(更多))。因此，需要较少的固定相物质，导致节约了柱物质和空间，并且当然需要较少的要运行通过柱的含有C1-INH的水溶液的体积。可替代地，可以将较大体积的含C1-INH的起始物料装载在现存尺寸的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.使用疏水相互作用色谱法用于纯化C1-INH的方法，其包括以下步骤：/n(i)在其中C1-INH结合到固定相的第一条件下，将含有溶解在其中的C1-INH的溶液装载在包含固定相的疏水相互作用色谱柱上，/n(ii)应用第二条件，以便借助于流动相洗脱C1-INH。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181017 EP 18201032.21.使用疏水相互作用色谱法用于纯化C1-INH的方法，其包括以下步骤：
(i)在其中C1-INH结合到固定相的第一条件下，将含有溶解在其中的C1-INH的溶液装载在包含固定相的疏水相互作用色谱柱上，
(ii)应用第二条件，以便借助于流动相洗脱C1-INH。


2.根据权利要求1的方法，其特征在于
-第一条件是流动相包含第一浓度的抗离液盐，优选硫酸钠或硫酸铵，最优选硫酸铵，其中C1-INH结合到固定相，和
-第二条件是流动相包含第二浓度的抗离液盐，优选硫酸钠或硫酸铵，最优选硫酸铵，其中C1-INH被洗脱。


3.根据权利要求2的方法，其中借助于浓度梯度或借助于梯级洗脱实现从第一浓度到第二浓度的转变。


4.根据权利要求2或3的方法，其中所述固定相选自以下基质物质中的一种或多种：琼脂糖，交联琼脂糖(以各种商品名出售，诸如)，亲水聚合物，例如聚甲基丙烯酸酯，其被诸如以下的疏水配体取代
-直链烷基，例如乙基、丁基、辛基，
-分枝的烷基，例如叔丁基
-芳基，例如苯基，或
-环烷基，例如己基
其中固定相优选是被烷基或芳基，优选丁基或苯基取代的基质物质，且更优选被丁基或苯基取代的交联琼脂糖，最优选被苯基取代的交联琼脂糖。


5.根据权利要求4的方法，其中所述固定相是苯基取代的凝胶，诸如GE医疗的Phenyl6FastFlow(低取代)。


6.根据权利要求5的方法，其中使用硫酸铵作为离液盐，并且所述第一浓度高于在约1.1M至约1.4M的范围中的浓度X(例如，高于在约155至约180mg/ml硫酸铵的范围中的浓度X)，优选在约1.2M至约1.3M的范围中(例如，高于在约160至约174mg/ml硫酸铵的范围中的浓度X)，并且其中所述第二浓度低于浓度X。


7.根据权利要求4的方法，其中所述固定相是丁基取代的凝胶，诸如GE医疗出...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·科尔尼洛娃，H·N·维尔卡，
申请(专利权)人：德国杰特贝林生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE