CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法与应用技术方案

本发明专利技术公开了一种CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法与应用。该方法包括如下步骤：利用Cas13a/crRNA复合体识别Target RNA，触发Cas13a非特异性剪切RNA探针的活性，从而剪切pre‑trigger；然后将得到的产物通过T4PNK酶去磷酸化处理后得到mature‑trigger，随后进行EXPAR反应，得到dsDNA产物；再将EXPAR扩增产物与含有“光开关”分子和TPrA的溶液进行混合后进行pBPE‑ECL检测，根据获得的有效信号值，即可实现miRNAs检测的目的。

CRISPR / cas13a combined with ECL system for microRNA detection

【技术实现步骤摘要】
CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法与应用
本专利技术涉及生物检测
，特别涉及一种CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法与应用。
技术介绍
成熟microRNAs(miRNAs)是真核生物体内一类具有调控功能的非编码小RNA，长度约为18～25nt。目前研究表明，许多癌症的发生与miRNAs异常表达有密切关系，miRNAs有望成为潜在的早期癌症诊断的标志物。因此，快速、灵敏地检测miRNAs对癌症早期诊断及治疗具有重要意义。由于miRNA在细胞中表达量低，本身序列短，与探针杂交不稳定，因此对于miRNAs的检测具有很大的挑战。目前传统的miRNAs检测方法包括RNA印迹法、实时定量PCR法、微阵列技术和下一代测序技术等，这些方法都有各自的优势，但操作过程复杂、检测成本高、灵敏度较低或特异性差等局限使这些方法在应用上受到很大的限制。例如最常用的检测方法是实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术，该方法可以达到较高的灵敏度，但miRNAs序列短，其长度相当于引物长本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：/n(1)将miRNA、pre-trigger与Cas13a/crRNA复合体混合均匀后于37℃条件下孵育30～40min，得到触发链；/n(2)将T4 PNK酶加入到步骤(1)中得到的触发链中，37℃条件下反应30～50min，得到成熟的触发链；/n(3)将步骤(2)中得到的成熟的触发链加入到EXPAR反应体系中进行扩增反应，得到dsDNA产物；/n(4)将步骤(3)中得到的dsDNA产物与含有“光开关”分子和TPrA的溶液混合后进行pBPE-ECL检测，在pBPE的阳极获得ECL信...

【技术特征摘要】
1.一种CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)将miRNA、pre-trigger与Cas13a/crRNA复合体混合均匀后于37℃条件下孵育30～40min，得到触发链；
(2)将T4PNK酶加入到步骤(1)中得到的触发链中，37℃条件下反应30～50min，得到成熟的触发链；
(3)将步骤(2)中得到的成熟的触发链加入到EXPAR反应体系中进行扩增反应，得到dsDNA产物；
(4)将步骤(3)中得到的dsDNA产物与含有“光开关”分子和TPrA的溶液混合后进行pBPE-ECL检测，在pBPE的阳极获得ECL信号，根据获得的信号值，实现对microRNA的检测。


2.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的miRNA为miRNA-17，其核苷酸序列如下所示：
5'-CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG-3'；
步骤(1)中所述的pre-trigger的核苷酸序列如下所示：
5'-TTGGATGGATATTGT-rUrU-CATA-3'；
步骤(1)中所述的Cas13a/crRNA复合体为由Cas13a蛋白和crRNA复合得到的复合体；
所述的Cas13a蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；
所述的crRNA的序列如下所示：
5'-GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACCUACCUGCACUGUAAGCACUUUG-3'。


3.根据权利要求2所述的CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法，其特征在于：
所述的crRNA为通过互补的两条DNA单链退火得到，其序列如下所示：
有义链：5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGACCACCCCAAAAATGAAGGGGACTAAAACCTACCTGCACTGTAAGCACTTTG-3'；
反义链：5'-CAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGGTTTTAGTCCCCTTCATTTTTGGGGTGGTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC-3'；
编码所述LbuCas13a蛋白的基因序列如SEQIDNO.2所示。


4.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的扩增反应通过如下步骤实现：
(I)配制EXPAR反应溶液：EXPAR反应溶液包括A溶液和B溶液，其中，A溶液包括0.1μM的扩增模板，250μM的dNTPmix和10％(v/v)成熟的触发链；B溶液包括0.4U/μL的Nt.BstNBI切刻内切酶，0.05U/μL的ventDNA聚合酶，1×Thermopolbuffer和1×NEBuffer3.1；其中，A溶液中的扩增模板的序列如下所示：
5'-AACTATCAACAATATCCATCCAAACAGACTCAAACTATCAACAATATCCATCCAA-3'；
(II...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢达，黄茹，周婷，黄梦琪，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东;44