一种无载体氯霉素适配体信号放大传感器的建立方法技术

一种无载体氯霉素适配体信号放大传感器的建立方法属于抗生素等物质检测领域。本发明专利技术的目的在于建立一个不需载体的适配体传感器，尽量降低实验成本，实现对抗生素残留的快速、高灵敏检测。本发明专利技术以氯霉素适配体为例，借助一条两端分别修饰淬灭和荧光基团的辅助短链以形成互补双链，通过加入核酸外切酶I(EXO I)实现释放并循环放大荧光信号，建立一个无载体的氯霉素适配体信号放大传感器。本发明专利技术借助EXO I酶的酶切活性将竞争亲和得到的适配体‑靶标复合物中适配体链分解并释放靶标，从而使靶物进入循环反应得到放大信号。

A method of signal amplification sensor without carrier chloramphenicol aptamer

【技术实现步骤摘要】
一种无载体氯霉素适配体信号放大传感器的建立方法
本专利技术属于抗生素等物质检测领域，特别涉及到在无载体溶液体系中由核酸外切酶I(EXOI)介导的信号放大传感器用于检测氯霉素的方法。目前利用适配体检测氯霉素的传感器大多需要借助石墨烯、纳米金等载体来固定适配体。该方法可为无载体适配体传感器的建立提供新思路。
技术介绍
氯霉素(chloramphenicol，CAP)是一类广谱类抗生素，是伤寒、副伤寒的首选药，也用于治疗厌氧菌感染，且效果十分显著、杀菌力极强。但是由于氯霉素用药有严重不良反应：抑制骨髓造血机能，引起再生障碍性贫血，目前联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂专家委员会建议禁止将氯霉素用于食用动物，我国也已禁止用于动物源性食品动物，中华人民共和国农业部公告第193号已将其列入《禁用清单》。但由于其价格低廉、制备简单易得，为防止不法商家将其用做兽药对人体健康造成危害，对氯霉素进行高效且快速的检测方法的建立是一份十分迫切且重要的任务。氯霉素传统检测的方法包括微生物检测、色谱检测和酶联免疫检测等，但这些检测方法都有一定缺陷，例如检测灵敏度低或者仪器成本高等。适配体(Aptamer)是一种能够特异性识别并与靶标结合的DNA或RNA核酸链，其较抗体而言具有更明显的优势，如靶标范围更广、制备更方便、化学稳定性好、易修饰等。因此适配体被广泛应用于检测药物、毒素、农药、蛋白质、病毒和细菌等的生物传感器，应用在食品安全控制、环境监测和临床诊断治疗等领域。适配体传感器的重要组成部分是针对靶标的特异性适配体，其具有高特性、高亲和性。利用适配体与靶标的高度亲和力作用，将适配体从辅助探针链上竞争置换下来，从而引发一系列的化学、电化学、光学等反应，产生与靶标浓度相关的信号输出，建立原始靶标浓度与输出信号的特定关系公式。现有的基于适配体的氯霉素传感器大多需要磁性纳米微球、纳米金、金电极等载体介质，适配体需要通过辅助基团如巯基、生物素基团、氨基等通过与对应载体上的基团共价连接。本专利技术以氯霉素适配体为例，建立了由EXOI酶介导放大信号的无载体抗生素生物传感器，能够实现简易快速检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于建立一个不需载体的适配体传感器，尽量降低实验成本，实现对抗生素残留的快速、高灵敏检测。本专利技术以氯霉素适配体为例，借助一条两端分别修饰淬灭和荧光基团的辅助短链以形成互补双链，通过加入核酸外切酶I(EXOI)实现释放并循环放大荧光信号，建立一个无载体的氯霉素适配体信号放大传感器。1.一种无载体氯霉素适配体信号放大传感器的建立方法，其特征在于：1).合成以下序列，即氯霉素核酸适配体和辅助探针：CAP-适配体:5’-CAATAAGCGATGCGCCCTCGCCTGGGGGCCTAGTCCTCT-3’探针Probe:5’FAM-AGAGGACTAGGC-3’BHQ12).氯霉素检测体系的建立2.1.1选用B&W缓冲液或PBS缓冲液分别作为所建体系的环境缓冲液，其中缓冲液中NaCl浓度取0.2M-0.8M，将终摩尔浓度比为0.8:1-1.2:1的CAP-适配体与辅助探针Probe分别加入到离心管中，其中Probe终浓度为0.25μM，95℃加热处理5min，置于室温下降温；2.1.2待冷却至室温后，离心管置于低于辅助探针链退火温度的10℃-15℃条件下，于培养箱中以120rpm转速下震荡孵育1h；2.1.3向上步骤中结束后的离心管中加入终浓度为0.1-5ng/mL的氯霉素和EXOI酶，其中EXOI酶的终浓度为0.5U/μL，置于10℃培养箱中120rpm条件下震荡孵育，选取20min-80min的孵育时间；2.1.4上步骤结束后将离心管置于85℃水浴，加热处理15min，灭活EXOI酶。进一步的优化方案：2.1向NaCl浓度为0.4M的PBS缓冲液中加入摩尔浓度为0.20μM的CAP-适配体和0.25μM辅助探针Probe于离心管中，95℃加热处理5min，置于室温下降温；2.2待冷却至室温后，将离心管置于孵育最佳温度10℃培养箱中以120rpm转速下震荡孵育1h；2.3向上步骤中结束后的离心管中加入终浓度为0.1-5ng/mL氯霉素和EXOI酶，其中EXOI酶的终浓度为0.5U/μL，置于10℃的培养箱中120rpm条件下震荡孵育70min；2.4上步骤结束后，将离心管置于85℃水浴，加热处理15min，灭活EXOI酶。上述目的通过以下技术方案实现：1.合成以下序列，即氯霉素核酸适配体和辅助探针：CAP-适配体:5’-CAATAAGCGATGCGCCCTCGCCTGGGGGCCTAGTCCTCT-3’探针Probe:5’FAM-AGAGGACTAGGC-3’BHQ12.氯霉素检测体系的建立实验所用缓冲液：Tris-HCl缓冲液：三羟甲基氨基甲烷(Tris)40mM，氯化镁(MgCl2)67mM，二硫苏糖醇(DTT)1mM，pH9.5。B&W缓冲液：氯化钠(NaCl)2M，三羟甲基氨基甲烷(Tris)10mM，乙二胺四乙酸二钠(EDTANa2)1mM，pH7.5。PBS缓冲液：氯化钠(NaCl)137mM，氯化钾(KCl)2.7mM，磷酸氢二钠(Na2HPO4)10mM，磷酸二氢钾(KH2PO4)2mM，pH7.4。2.1无载体检测体系的可行性验证2.1.1选用B&W缓冲液或PBS缓冲液分别作为所建体系的环境缓冲液，其中缓冲液中NaCl浓度取0.2M-0.8M，将终摩尔浓度比为0.8:1-1.2:1的CAP-适配体与辅助探针Probe分别加入到离心管中，其中Probe终浓度为0.25μM，95℃加热处理5min，置于室温下降温；2.1.2待冷却至室温后，离心管置于低于辅助探针链退火温度的10℃-15℃条件下，于培养箱中以120rpm转速下震荡孵育1h；2.1.3向上步骤中结束后的离心管中加入终浓度为0.1-5ng/mL的氯霉素和EXOI酶，其中EXOI酶的终浓度为0.5U/μL，置于10℃培养箱中120rpm条件下震荡孵育，选取20min-80min的孵育时间；2.1.4上步骤结束后将离心管置于85℃水浴，加热处理15min，灭活EXOI酶。2.2检测体系的建立方法2.2.1向NaCl浓度为0.4M的PBS缓冲液中加入摩尔浓度为0.20μM的CAP-适配体和0.25μM辅助探针Probe于离心管中，95℃加热处理5min，置于室温下降温；2.2.2待冷却至室温后，将离心管置于孵育最佳温度10℃培养箱中以120rpm转速下震荡孵育1h；2.2.3向上步骤中结束后的离心管中加入终浓度为0.1-5ng/mL氯霉素和EXOI酶，其中EXOI酶的终浓度为0.5U/μL，置于10℃的培养箱中120rpm条件下震荡孵育70min；2.2.4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无载体氯霉素适配体信号放大传感器的建立方法，其特征在于：/n1).合成以下序列，即氯霉素核酸适配体和辅助探针：/nCAP-适配体:/n5’-CAATAAGCGATGCGCCCTCGCCTGGGGGCCTAGTCCTCT-3’/n探针Probe:/n5’FAM-AGAGGACTAGGC-3’BHQ1/n2).氯霉素检测体系的建立/n2.1.1选用B&W缓冲液或PBS缓冲液分别作为所建体系的环境缓冲液，其中缓冲液中NaCl浓度取0.2M-0.8M，将终摩尔浓度比为0.8:1-1.2:1的CAP-适配体与辅助探针Probe分别加入到离心管中，其中Probe终浓度为0.25μM，95℃加热处理5min，置于室温下降温；/n2.1.2待冷却至室温后，离心管置于低于辅助探针链退火温度的10℃-15℃条件下，于培养箱中以120rpm转速下震荡孵育1h；/n2.1.3向上步骤中结束后的离心管中加入终浓度为0.1-5ng/mL的氯霉素和EXO I酶，其中EXO I酶的终浓度为0.5U/μL，置于10℃培养箱中120rpm条件下震荡孵育，选取20min-80min的孵育时间；/n2.1.4上步骤结束后将离心管置于85℃水浴，加热处理15min，灭活EXO I酶。/n...

【技术特征摘要】
1.一种无载体氯霉素适配体信号放大传感器的建立方法，其特征在于：
1).合成以下序列，即氯霉素核酸适配体和辅助探针：
CAP-适配体:
5’-CAATAAGCGATGCGCCCTCGCCTGGGGGCCTAGTCCTCT-3’
探针Probe:
5’FAM-AGAGGACTAGGC-3’BHQ1
2).氯霉素检测体系的建立
2.1.1选用B&W缓冲液或PBS缓冲液分别作为所建体系的环境缓冲液，其中缓冲液中NaCl浓度取0.2M-0.8M，将终摩尔浓度比为0.8:1-1.2:1的CAP-适配体与辅助探针Probe分别加入到离心管中，其中Probe终浓度为0.25μM，95℃加热处理5min，置于室温下降温；
2.1.2待冷却至室温后，离心管置于低于辅助探针链退火温度的10℃-15℃条件下，于培养箱中以120rpm转速下震荡孵育1h；
2.1.3向上步骤中结束后的离心管中加入终浓度为0.1-5ng...

【专利技术属性】
技术研发人员：李灏，杜晓彦，张莹，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11