基于TdT酶和NtbspQI切刻酶联用检测脑胶质瘤标志物的方法技术

本发明专利技术公开一种基于末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和NtbspQI切刻酶联用信号放大检测脑胶质瘤标志物的方法。首先，利用NtbspQI切刻酶的特定位点切割DNA和以dTTP为底物，利用TdT的无模板3端生长polyT的功能，将传统的单纯检测miRNA转化为利用铜离子检测polyT，实现了miRNA‑153的高效、快捷、灵敏度高、特异性强的检测，该方法具有良好的特异性、灵敏度以及抗干扰能力，为建立灵敏而特异的miRNA检测方法提供了新方向。

Detection of glioma markers based on TDT and ntbspqi

【技术实现步骤摘要】
基于TdT酶和NtbspQI切刻酶联用检测脑胶质瘤标志物的方法
本专利技术属于生物
，具体为一种基于TdT酶和NtbspQI切刻酶联用检测脑胶质瘤标志物的方法。
技术介绍
近些年来，很多微小RNA(microRNAs,miRNAs)已经成为了癌症早期诊断的潜在肿瘤标志物。已知的miRNAs中，有50％与多种人类肿瘤有关，这些miRNAs的异常表达与肿瘤的发生和发展有密切的关系。其中，脑胶质瘤(脑胶质细胞瘤)约占颅内肿瘤的46％。世界卫生组织1998年公布按死亡率顺序排位，恶性胶质瘤是34岁以下肿瘤患者的第2位死亡原因，是35～54岁患者的第3位死亡原因。致死率皆位居前列。由于目前我国癌症患者的数量增长非常迅速，因此，对癌症的科学预防、早期诊断，及时治疗以及术后监测，已成为具有重要意义的研究课题与方向。很多生物学研究已经证实，实现对癌症的早期诊断，可以有效提高癌症的存活率，通过对miRNA的灵敏检测可以对肿瘤的发生、发展、转移以及预后起到重要的作用。本专利技术中示例待检miRNA为miRNA-153，它是脑胶质瘤中重要的分子生物学标志物。传统检测方法主要包括Northern印迹法，微阵列和逆转录酶实时定量PCR(RT-PCR)。这些方法中，实时定量PCR技术相对其他两种技术来说操作简单、灵敏度和特异性较好。然而，因为miRNA有着序列短、表达量低以及稳定性相对较差的特点，所以逆转录实时定量PCR技术通常需要复杂的引物设计或引物修饰，这对于miRNA的灵敏而通用的检测是不利的。在本专利技术中，设计了一种由末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)和NtbspQI切刻酶联用进行信号放大的方法。该方法利用NtbspQI切刻酶在酶切位点进行切割，这样释放出3端羟基，TdT在3端以dTTP为底物进行延伸，长出的polyT又会被切刻酶切割，通过控制两种酶的比例，从而控制polyT的长度，切割下来的polyT和加入进去的铜离子通过还原剂的作用，使铜离子还原成0价铜，结合在polyT上，通过酶标仪检测荧光值，从而确定miRNA的量，达到了对痕量miRNA的定量检测。同时，该方案具有良好的特异性、灵敏度以及抗干扰能力，为其进一步应用提供了科学依据。
技术实现思路
我们研发了一种基于末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)和NtbspQI切刻酶联用信号放大检测脑胶质瘤标志物miRNA-153的方法。首先，利用NtbspQI切刻酶的特定位点切割DNA和以dTTP为底物，利用TdT的无模板3端生长polyT的功能，将传统的单纯检测miRNA转化为利用铜离子检测polyT，实现了miRNA-153的高效、快捷、灵敏度高、特异性强的检测，该方法具有良好的特异性、灵敏度以及抗干扰能力，为建立灵敏而特异的miRNA检测方法提供了新方向。本专利技术的技术方案实现对miRNA-153的高效、快捷、灵敏度、特异性的检测，具体检测步骤如下：(1)(序列一)和DNA探针(序列二)与miRNA-153结合茎环结构以及DNA探针由100uM稀释到10uM，加入20ul体系中2ul使终浓度为1uM，控制不同的miRNA-153的加入量，常温混合反应1h，使三个结构发生构象变化。(2)加入酶加入TdT酶和NtbspQI切刻酶，37°反应1h后85°灭活25min。(3)加入铜离子和还原剂加入铜离子和还原剂后室温反应20min后，用酶标仪测量荧光值，根据荧光值表征出miRNA的含量。(4)实验优化及数据处理分别对整个流程中探针序列、缓冲液种类、酶比例进行筛选，对探针用量、反应时间、温度等参数进行优化，最终得到该方法的最佳条件。附图说明图1反应原理图；图2最适缓冲液琼脂糖电泳表征图；图3DNA探针和茎环的设计；图4NtbspQI切刻酶酶切位点；图5最适酶比例琼脂糖电泳表征图。具体实施方式下面的实施案例中将对本专利技术作进一步的阐述，但本专利技术不限于此。本专利技术的具体步骤如下：图1为本专利技术的反应原理图。(1)可行性实验：为了在实验可以顺利进行，需要探究出最适合两种酶的buffer，对于TdT的buffer是RB10×和CoCl2，NtbspQI切刻酶的buffer是NEBuffer3.1，所以为了选择出最适合的buffer，做了以下的探究，a)两者buffer均加入反应体系；b)只加TDT的buffer；c)只加NtbspQI切刻酶发buffer；d)加入CoCl2和NEBuffer3.1；e)加入RB10×和NEBuffer3.1。最终可以判断出来，CoCl2是TdT必须的buffer，但是NEBuffer3.1的存在会使TDT的buffer失效，而NtbspQI切刻酶在TdT的buffer中是可以正常使用，所以，最后得出结论，两个酶联用的时候最合适的buffer是RB10×和CoCl2。如图2所示。(2)茎环和DNA探针的选择为了实验结果有更好的灵敏度与稳定性，我们设计了一个茎环和一个DNA探针：茎环结构5’-GATCACTTTTGCTCTTCAAAAG-3’DNA探针5’-TTGAAGAGTGACTATGCAA-3’mi-RNA-1535’-UUGCAUAGUCACAAAAGUGAUC-3’由图3可以看出，茎环结构和DNA探针分别有一部分和miRNA-153互补配对，同时miRNA-153和DNA探针也有一部分可以互补配对，NtbspQI切刻酶的切割位点如图4所示，该位点存在在茎环结构的茎上，当没有目标物存在的时候，由于茎环足够稳定，不能和DNA探针互补配对，所以就算有酶存在也没办法进行切割，同时3端被封死，所以两种酶都不发挥作用。当有目标物存在的时候，就会把茎环打开，那么NtbspQI切刻酶的切割位点就暴露出来，就可以进行切割，随后TdT因为底物的存在就可以在暴露出来的3端进行延伸。(3)最适TdT和NtbspQI切刻酶的比例为了避免NtbspQI切刻酶切割后暴露出3端后，TdT长点就切，没办法生成较长的polyT，所以要降低NtbspQI切刻酶的浓度，所以要探究一下最合适的TdT和NtbspQI切刻酶的比例。TdT和NtbspQI切刻酶调整为：1:1、2:1、5:1、10:1结果如图5所示。序列表<110>天津大学<120>基基于TdT酶和NtbspQI切刻酶联用检测脑胶质瘤标志物的方法<160>3<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>22<212>RNA<213>脑胶质瘤(ArtificialSequence)<400>1uugcauagucacaaaagugauc22<210>2<211&本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于TdT酶和NtbspQI切刻酶联用检测脑胶质瘤标志物的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)茎环结构和DNA探针与miRNA-153充分结合，发成构象变化，提供出NtbspQI切刻酶切割位点；(2)同时加入NtbspQI切刻酶和TdT，进行切割和延伸；(3)生成的polyT中加入铜离子，再加入还原剂，通过铜和polyT结合后给予335nm的激发光，可以给出565nm的发射光。/n

【技术特征摘要】
1.基于TdT酶和NtbspQI切刻酶联用检测脑胶质瘤标志物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)茎环结构和DNA探针与miRNA-153充分结合，发成构象变化，提供出NtbspQI切刻酶切割位点；(2)同时加入NtbspQI切刻酶和TdT，进行切割和延伸；(3)生成的polyT中加入铜离子，再加入还原剂，通过铜和polyT结合后给予335nm的激发光，可以给出565nm的发射光。


2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，用于检测微小RNA的是由TdT和NtbspQI切刻酶联用。


3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，用于检测微小RNA的由TdT和NtbspQI切刻酶联用时，只可使用TdT所携带的buffer，NtbspQI切刻酶所携带的NEBuffer.3.1的存在会影响TdT的活性，切...

【专利技术属性】
技术研发人员：常津，崔警予，宫晓群，朴佳芳，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12