炎症性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用技术

本发明专利技术公开了生物工程领域的炎症性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用，拟解决弥补现有技术中在IBD抗免疫治疗中的作用及机制下FGL2的评价方法及其作用，为了实现上述目的，本技术方案如下利用FGL2的角色缺失的实验背景，结合拮抗IBD过度激活的免疫反应，外源性输入FGL2以建立FGL2的免疫调节通路的研究方法。本技术属于开创性发明专利技术，提供了FGL2在IBD中的研究方法，便于深入剖析IBD中FGL2的作用，同时本技术方案中免疫调节通路的构建便于FGL2作用机制的阐明，并对FGL2研究提供全新的角度。

Establishment and application of fgl2 gene knockout in inflammatory bowel disease

【技术实现步骤摘要】
炎症性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用
本专利技术属于生物工程领域，具体是炎症性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用。
技术介绍
炎症性肠病(Inflammatoryboweldisease，IBD)是一种病因尚不十分清楚的慢性肠道炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎(Ulcerativecolitis，UC)和克罗恩病(Crohn’disease，CD)。该病在西方国家相当常见，欧洲和北美UC的发病率为10-20/105，患病率100-200/105；CD的发病率为5-10/105，患病率达50-100/105。世界胃肠病组织2010年的临床指南中提到，IBD发病率在全世界范围内，尤其东亚地区有持续上升趋势，目前该病已成为消化系统常见疾病和慢性腹泻的主要病因，IBD的发病机制研究目前主要涉及遗传学因素、肠道屏障破坏和肠道菌群、免疫调节异常等方面，其中免疫调节异常是最为活跃的研究领域，但其确切发病机制尚不明确，给临床诊治带来极大的困扰，给人类健康带来了极大的潜在威胁，引起了亚洲乃至全世界的高度重视。1998年Marazzi等第一次发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.炎症性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用，其特征在于：利用FGL2的角色缺失的实验背景，结合拮抗IBD过度激活的免疫反应，外源性输入FGL2以建立FGL2的免疫调节通路的研究方法。/n

【技术特征摘要】
1.炎症性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用，其特征在于：利用FGL2的角色缺失的实验背景，结合拮抗IBD过度激活的免疫反应，外源性输入FGL2以建立FGL2的免疫调节通路的研究方法。


2.根据权利要求1所述的炎症性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用，其特征在于：包括以下步骤；
S1，构建IBD动物模型，并且以临床分期的特征构建初期、活动期和治疗缓解期的模型体；
S2，构建FGL2敲除的模型小鼠，在明确FGL2缺失的基因背景下Treg细胞的功能状态、CD8+细胞毒性T细胞、B淋巴细胞、DC细胞的活性改变；
S3，对于步骤2中的小鼠外源性补充FGL2生物制剂，判断FGL2所涉及的下游免疫活性调节的具体环节；
S4，在FGL2基因敲除小鼠的基础上，进一步诱导IBD模型，比较CD8+细胞毒性T细胞、B淋巴细胞、DC细胞免疫功能的改变；
S5，研究FGL2生物制剂对IBD免疫平衡的影响。


3.根据权利要求2所述的对于炎症性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用，其特征在于：所述步骤1中小鼠模型的诱导方法为三硝基苯磺酸法，随后对于小鼠临床分期的评价方法为对小鼠肠道组织常规活体取材，制成石蜡切片，利用HE染色镜下观察病理组织学变化，从而以炎症细胞浸润程度进行分组。


4.根据权利要求3所述的炎症性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用，其特征在于：分组方式如下，按照炎症反应依次分为A1组、A2组和A3组；
A1组为炎症细胞浸润程度<50％的小鼠模型；
A2组为炎症细胞浸润程度>50％的小鼠模型；
A3组为将病理下炎症细胞浸润程度逆转<50％的小鼠模型。


5.根据权利要求4所述的炎症性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用，其特征在于：基于A2组研究FGL2分子在IBD小鼠外周血及肠道组织中的表达,研究方法如下；
1)根据NCBI(theNationalCenterforBiotechnologyInformation)上FGL2、FoxP3、RORγT编码序列，利用相关软件设计引物；
2)制备A2组小鼠外周血及肠道组织样本，试剂盒操作下提取cDNA，进行实时荧光定量PCR扩增；
3)获取FGL2单克隆抗体，应用免疫组织化学法检测肠道组织中FGL2、FoxP3蛋白表达量；同时测定正常对照组小鼠外周血及肠道组织样本中FGL2、FoxP3、RORγT的mRNA表达及FGL2、FoxP3蛋白表达。


6.根据权利要求5所述的炎症性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用，其特征在于：制备A1、A2和A3的IBD小鼠及正常对照小鼠的血浆样本，利用酶联免疫吸附试验分布测定sFGL2、IL-17、IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10的浓度，分析IBD不同状态下，上述细胞因子的变化方向并解释可能的机制,魏氏法检测ESR(血沉)的变化情况；利用免疫比浊法的CRP测定试剂盒测定CRP在不同分组中的数值。


7.根据权利要求6所述的炎症性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用，其特征在于：
i)获取A2组IBD小鼠组织和血浆，制备单细胞悬液，采用流式细胞术(FlowCytometry,FCM)分析CD4+CD25+Treg细胞占总CD4+T百分比、CD4+IL-17+标记Th17占总CD4+T百分比；
ii)采用免疫磁珠两步法分离小鼠外周血单个核细胞中的CD4+CD25+Treg细胞，分离后的细胞经抗体染色后经流式细胞仪检测其分离纯度；
iii)应用Westernblot及实时荧光定量PCR技术分别检测CD4+CD25+Treg细胞中FGL2蛋白及mRNA表达水平,同理获得纯化的Th17...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄智铭，陈仁聘，蒋学佩，陈茹茹，林海华，王顺才，
申请(专利权)人：温州医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33