【技术实现步骤摘要】
一种用于检测AQP4抗体的细胞爬片及应用(一)
本专利技术涉及一种检测人体血清中AQP4抗体的细胞爬片及应用于检测人体血清中AQP4抗体的方法。(二)
技术介绍
中枢神经系统脱髓鞘疾病是一类轴索相对完整但脑和脊髓神经的纤维髓鞘脱失的疾病。多发性硬化(MS)和视神经脊髓炎(NMO)是较常见的两种不同的中枢神经系统脱髓鞘疾病。但是这两类中枢神经系统脱髓鞘疾病因其临床症状复杂多变，诊断和鉴别区分也相对困难。2004年科研人员首次在NMO患者血清中发现NMO-IgG能与抗水通道蛋白4(AQP4)产生特异性结合，NMO-IgG被证实为抗AQP4抗体。逐渐地，医学诊断标准将人体血清中血清的抗AQP4抗体阳性作为NMO区别于MS的诊断支持条件。目前，流式细胞分析法检测抗AQP4抗体对NMO诊断的敏感性和特异性相对较高，是目前主要使用的诊断方法。但该方法有许多明显的缺点：(1)需要临时培养细胞；(2)设备昂贵，不易普及；(3)对检验员技术要求高；(4)耗时相对较长。因此，该研究方法很难在临床推广使用。(三)专利技术内...
【技术保护点】
1.一种用于检测AQP4抗体的细胞爬片，其特征在于所述细胞爬片是将HEK293T细胞贴壁生长在盖玻片上，再用含AQP4基因的pCMV-HA-AQP4表达质粒转染HEK293T细胞，获得表达AQP4蛋白的HEK293T细胞并固定；同时未转染AQP4蛋白HEK293T细胞固定于盖玻片上；然后将表达AQP4蛋白的HEK293T细胞盖玻片和未转染AQP4蛋白的HEK293T细胞盖玻片间隔固定在同一个载玻片的相同面上，分别作为反应区和对照区，获得所述细胞爬片。/n
【技术特征摘要】
1.一种用于检测AQP4抗体的细胞爬片，其特征在于所述细胞爬片是将HEK293T细胞贴壁生长在盖玻片上，再用含AQP4基因的pCMV-HA-AQP4表达质粒转染HEK293T细胞，获得表达AQP4蛋白的HEK293T细胞并固定；同时未转染AQP4蛋白HEK293T细胞固定于盖玻片上；然后将表达AQP4蛋白的HEK293T细胞盖玻片和未转染AQP4蛋白的HEK293T细胞盖玻片间隔固定在同一个载玻片的相同面上，分别作为反应区和对照区，获得所述细胞爬片。
2.如权利要求1所述用于检测AQP4抗体的细胞爬片，其特征在于所述AQP4基因核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。
3.如权利要求1所述用于检测AQP4抗体的细胞爬片，其特征在于所述盖玻片厚度0.13-0.16mm，长50mm，宽24mm；所述载玻片厚度1mm，长75mm，宽25mm。
4.如权利要求1所述用于检测AQP4抗体的细胞爬片，其特征在于所述含AQP4基因的pCMV-HA-AQP4表达质粒按如下方法制备：以人类视神经cDNA为模板，通过PCR体外扩增的方法获得AQP4目的基因片段，并在目的基因的两端设SalI/NotI双酶切位点；将含有SalI/NotI双酶切位点的目的基因片段插入含有强组成型启动子CMV的pCMV-HA载体中，得到pCMV-HA-AQP4表达质粒；pCMV-HA-AQP4表达质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态中，提取pCMV-HA-AQP4表达质粒。
5.如权利要求1所述用于检测AQP4抗体的细胞爬片，其特征在于所述HEK293T细胞在盖玻片上贴壁生长方法为：在贴壁试剂原液中加入9倍体积的PBS，制得贴壁试剂工作液；在培养皿中加入贴壁试剂工作液，加入盖玻片，37℃孵育1小时后，弃掉贴壁试剂工作液，用PBS清洗盖玻片2次，每次5分钟，获得预处理后的盖玻片；按照DMEM培养基：FBS：双抗＝45：5：0.5的体积比配制完全培养基；将HEK293T细胞接种至含完全培养基的细胞培养皿，37℃培养至细胞生长密度达到90％以上，用Trypsin-EDTA把细胞从培养皿上消化下来，收集细胞，用完全培养基重悬细胞，即为细胞悬液；向含有预处理后盖玻片的培养皿中加细胞悬液，在37℃，5％CO2的培养箱培养过夜，获得贴附于盖玻片上生长的HEK293T细胞。
6.如权利要求1所述用于检测AQP4抗体的细胞爬片，其特征在于所述转染按如下方法进行：
(1)将pCMV-HA-AQP4表达质粒加入opti-mem无血清培养基制成15μg/500μL的A液；将Lipofectamine2000转染液以体积比40μL：500μL加入到opti-mem无血清培养基中，室温静置5...
【专利技术属性】
技术研发人员：施福东，李敏淑，金薇娜，方朝君，金立方，么阳，贾冬梅，
申请(专利权)人：天津天海新域生物科技有限公司，浙江达美生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12
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