一种负载NO的靶向微泡及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种负载NO的靶向微泡及其制备方法，微泡为中空的脂质体，脂质体表面结合有链霉亲和素，链霉亲和素与生物素修饰的C4d/C3d抗体偶联，脂质体内填充有NO/CO和高分子惰性气体的混合气体。本发明专利技术成功制备了NO‑MB

A targeted microbubble loaded with no and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种负载NO的靶向微泡及其制备方法和应用
本专利技术涉及心脏移植排斥治疗
，尤其是一种负载NO(一氧化氮)的C4d靶向微泡及其制备方法和应用。
技术介绍
心脏移植是治疗终末期心脏疾病的最佳方法，然而，心脏移植抗体介导的排斥(AMR)发生率仍然高且被认为是移植物失活的重要因素1。AMR是由抗供体特异性抗体(DSA)所致，DSA与移植物血管内皮细胞表面的抗体结合后，通过经典途径激活补体系统，损伤移植物。同时，C3a、C5a等趋化因子可以招募巨噬细胞、T细胞和B细胞等免疫细胞迁移到移植物，从而损伤移植物2。C4d是补体激活的裂解片段，可以共价结合在血管内皮细胞表面，被认为是AMR的特异性标记，然而其检测依赖于穿刺病理和免疫染色，为有创性3,4。我们前期已经成功合成C4d靶向微泡(MBC4d)并利用其实现了C4d的无创检测5。靶向超声显像技术具有很高的敏感性和特异性，已经广泛用于靶向细胞和分子的检测7。并且，负载药物或者特殊气体的微泡(MBs)经常用于治疗疾病8。MBC4d与发生了AMR的移植物内皮细胞表面的C4d结合后可以停留在移植物中，这使得它可以作为携带有治疗作用的药物或者气体的理想介质。高水平的一氧化氮(NO)在免疫系统中起着重要的作用，主要表现为抗炎和免疫抑制的作用9。大量研究证实NO可以抑制巨噬细胞活化，T细胞、B细胞的增殖和迁移10,11。NO也可以减少毛细血管内血小板聚集和血栓形成12。据我们所知，巨噬细胞、T细胞、B细胞和血栓形成在AMR的发生发展中起重要作用13-16。目前AMR的治疗方法包括清除DSA、抑制或清除B细胞或浆细胞和抑制补体等。然而，这些方法都是全身性的，表现为部分患者有效或短时间有效，花费高以及可能引起严重感染和毒性等并发症6。使得迫切需要专利技术AMR更为有效、安全和精准的治疗方法。
技术实现思路
基于上述问题，本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种能有效治疗心脏移植抗体介导的排斥的微泡，其用于AMR治疗时，具有安全和精准的特点。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种负载NO的C4d靶向微泡，所述微泡为中空的脂质体，所述脂质体表面结合有链霉亲和素，所述链霉亲和素与生物素修饰的C4d/C3d抗体偶联，所述脂质体内填充有NO/CO和高分子惰性气体的混合气体。需要说明的是，除了C4d抗体，链霉亲和素还可以与C3d抗体偶联，因为C3d在AMR中也是特异性表达，同样可以实现微泡靶向示踪的效果。在脂质体内除了可以填充NO，还可以填充具有抗炎效果的气体，例如CO等，可以起到辅助治疗ARM的效果；在脂质体内还可以填充惰性气体，但是不限于高分子惰性气体，还可以是氦(He)、氖(Ne)、氩(Ar)等稀有气体，优选为C3F8和/或SF6，更优选为C3F8。优选地，所述混合气体中含有NO，NO的体积百分比为1～100％，优选为25～100％。更优选地，所述混合气体中，含有体积百分比为25％的NO，以及体积百分比为75％的高分子惰性气体，所述高分子惰性气体为C3F8和/或SF6，优选为C3F8。需要说明的是，本申请的专利技术人多次试验发现，当NO-MBs(即负载NO的微泡)的内容气体为75％C3F8和25％NO时，其稳定性和对比度最佳。优选地，所述微泡的直径为0.89～1.03μm。作为本专利技术的另一个方面，本专利技术提供了上述微泡的制备方法，包括如下步骤：1)负载NO微泡的制备：将18mg1,2-dipalmitoyl-rac-glycero-3-phosphocholine、3.5mg1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethyleneglycol)-2000]、1mg1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate和0.72μgbiotin-DSPE-PEG2000溶于氯仿中，蒸发氯仿得到一层薄膜，然后加入含链霉亲和素的磷酸盐缓冲盐水对薄膜进行水化，并置于恒温摇床中振荡以获得脂质体，然后在真空条件下，将C3F8和NO的混合气体持续注入脂质体悬浮液中，经机械振动制备出表面带有链霉亲和素的NO-MBs；2)NO-MBC4d微泡的制备：对C4d抗体进行生物素化处理，然后与步骤1)所得表面带有链霉亲和素的NO-MBs偶联得到NO-MBC4d微泡。优选地，所述步骤1)的混合气体中NO的体积比为25～100％。更优选地，所述步骤1)的混合气体中NO体积百分比为25％，C3F8的体积百分比为75％。优选地，所述步骤2)包括：将生物素修饰的C4d抗体与NO-MBs在室温下孵育，然后离心洗涤，用针头吸除下层液体以去除未结合的抗体，重新用磷酸盐缓冲盐水重悬上层微泡，制备出NO-MBC4d微泡。本专利技术还提供了上述的微泡在制备治疗器官移植抗体介导的排斥的药物中的应用，其中所述器官为心脏或肾脏。需要说明的是，本专利技术中微泡可以应用的治疗领域包括但不限于心脏或肾脏，还可以是其它器官，例如肝脏等，优选为心脏。作为本专利技术的又一个方面，本专利技术提供了一种治疗心脏移植抗体介导的排斥的药物，其中含有上述的微泡。综上所述，本专利技术的有益效果为：本专利技术成功制备了NO-MBC4d这种新型微泡，并利用该微泡成功实现了心脏移植物AMR的靶向精准治疗，治疗过程安全性高，具有很好的临床应用前景。附图说明图1为不同浓度的NO对本专利技术的微泡在体外的清除时间和信号轻度的影响检测结果图，其中A图是不同NO浓度的微泡在不同时间点的体外造影图片；B图显示不同NO浓度的微泡在不同时间点的造影强度比较；C图显示不同NO浓度微泡的体外清除时间比较；图2为本专利技术中微泡结构、形状和尺寸图，其中A图是NO-MBC4d结构示意图，B图是NO-MBC4d微泡的显微镜照片，C图显示各微泡的直径与比例；图3为NO-MBC4d在发生AMR的移植物内聚集的检测结果图；图4为NO-MBC4d对AMR的影响结果检测图；图5为NO-MBC4d对AMR的移植物内免疫细胞影响的流式检测图及结果统计图；图6为NO-MBC4d对AMR的移植物内免疫细胞影响的免疫组化图及结果统计图；图7为NO-MBC4d对AMR的移植物内炎症因子影响的结果统计图。具体实施方式抗体介导的排斥(AMR)是移植物失功的重要原因。然而，目前其治疗方法均为全身系统性方案且效果总体欠佳。C4d是诊断AMR的特异性标记，我们前期利用C4d靶向微泡(MBC4d)成功实现了其无创诊断。本专利技术成功将MBC4d微泡负载一氧化氮(NO)，其中高浓度NO具有免疫调节和抗血栓的作用，从而实现AMR的精准治疗。在一些实施例中，本专利技术利用链霉亲和素-生物素偶联的方法制作出负载NO的MBC4d(NO-MBC4d)。利用BN→Lewis大鼠皮肤移植预致敏2周后行肾移植建立AMR模型。在不同C4d本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种负载NO的靶向微泡，其特征在于，所述微泡为中空的脂质体，所述脂质体表面结合有链霉亲和素，所述链霉亲和素与生物素修饰的C4d/C3d抗体偶联，所述脂质体内填充有NO/CO和高分子惰性气体的混合气体。/n

【技术特征摘要】
1.一种负载NO的靶向微泡，其特征在于，所述微泡为中空的脂质体，所述脂质体表面结合有链霉亲和素，所述链霉亲和素与生物素修饰的C4d/C3d抗体偶联，所述脂质体内填充有NO/CO和高分子惰性气体的混合气体。


2.根据权利要求1所述的微泡，其特征在于，所述混合气体中含有NO，NO的体积百分比为1～100％，优选为25～100％。


3.根据权利要求2所述的微泡，其特征在于，所述混合气体中，含有体积百分比为25％的NO，以及体积百分比为75％的高分子惰性气体，所述高分子惰性气体为C3F8和/或SF6，优选为C3F8。


4.根据权利要求1所述的微泡，其特征在于，所述微泡的直径为0.89～1.03μm。


5.权利要求1～4任一项所述的微泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)负载NO微泡的制备：
将18mg1,2-dipalmitoyl-rac-glycero-3-phosphocholine、3.5mg1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethyleneglycol)-2000]、
1mg1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate和0.72μgbiotin-DSPE-PEG2...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙启全，廖涛，
申请(专利权)人：中山大学附属第三医院，
类型：发明
国别省市：广东;44