一种柔嫩艾美耳球虫原生质体的染色方法技术

本发明专利技术涉及一种柔嫩艾美耳球虫原生质体的染色方法，包括以下步骤：(1)取新鲜分离的未成熟柔嫩艾美耳球虫卵囊，冻融循环；(2)采用盐酸‑乙醇处理冻融循环后的卵囊，作用后，离心洗涤去除作用液；(3)加入染料，进行柔嫩艾美耳球虫原生质体的荧光染色。本发明专利技术建立了一种保留未成熟柔嫩艾美耳球虫卵囊壁完整形态的破壁技术，首次报道了柔嫩艾美耳球虫原生质体的染色方法，程序简便，方法可信，结果鲜明，易于观察和判断。

A staining method for protoplasts of Eimeria tenella

【技术实现步骤摘要】
一种柔嫩艾美耳球虫原生质体的染色方法
本专利技术涉及一种寄生虫的染色方法，具体是建立了一种保留柔嫩艾美耳球虫卵囊壁完整形态的破壁技术，提供了一种染色步骤简单、操作方便的球虫原生质体染色法。
技术介绍
未成熟的柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)卵囊壁是一个坚固、致密的组织结构，能够耐受一定的机械损伤，常规化学制品、消化酶、洗涤液以及低渗溶液很难破坏球虫的卵囊壁结构。卵囊壁在成熟前后发生了结构上的显著改变，此时对于成熟的已孢子化E.tenella卵囊必须采用研磨器反复研磨的机械方法才能在某种程度上破坏卵囊壁，让成熟的孢子囊游离出来，但会使球虫的卵囊壁裂解成若干小碎片，整体结构将不复存在。对于未成熟卵囊，保持其卵囊壁外形的情况下对卵囊内原生质体进行染色未见相关报道。因此，国内外学者很难在体外破壁后用常规染料渗透卵囊壁去着色未成熟E.tenella原生质体。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术的目的就是为了克服传统机械方式无法保留未成熟E.tenella卵囊壁完整形态的技术缺陷，建立了一种全新的破壁技术，进而实现球虫原生质体染色。技术方案：本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：一种柔嫩艾美耳球虫原生质体的染色方法，包括以下步骤：(1)取新鲜分离的未成熟柔嫩艾美耳球虫卵囊，冻融循环；(2)采用盐酸-乙醇水溶液处理冻融循环后的卵囊，作用后，离心洗涤去除作用液；(3)加入染料，进行柔嫩艾美耳球虫原生质体的荧光染色。优选：所述冻融循环是分别置于4℃和-20℃条件下，每次作用时间为14-16min。所述盐酸是浓度为36～38％的浓盐酸，所述乙醇水溶液为93-97％的乙醇水溶液，盐酸-乙醇水溶液的体积比为1:(0.5-1.5)。所述染料为Hoechst33258染料，其终浓度为0.5-1.5μg/ml。所述冻融循环的次数为三次，离心洗涤的次数为三次。所述采用盐酸-乙醇水溶液处理冻融循环后的卵囊，作用时间为3-5h，作用温度为4℃。所述卵囊，是球虫感染鸡后从盲肠中分离的新鲜未成熟柔嫩艾美耳球虫卵囊。更优选的方法如下：(1)取球虫感染鸡后从盲肠中分离的新鲜未成熟柔嫩艾美耳球虫卵囊，分别置于4℃和-20℃条件下冻融循环三次，每次作用时间为15min；(2)采用37％浓盐酸-95％乙醇水溶液(体积比为1:1)处理冻融循环后的卵囊，作用4h后，三次离心洗涤去除作用液；(3)调整卵囊浓度为1×103个/μl，加入Hoechst33258染料，调整染料的终浓度为1μg/ml；(4)在激发波长532nm下，荧光倒置显微镜暗视野下观察卵囊内原生质体的荧光特性。本专利技术采用冻融循环技术和盐酸-乙醇预处理，建立了一种可以完好保存未成熟E.tenella卵囊壁整体形态的破壁技术和球虫原生质体染色方法。采用荧光显微镜暗视野聚光器，增强染色卵囊的亮度和反衬度，提高图像质量，易于观察荧光染色的原生质体。冻融循环技术是指物质结构外部和内部水分的冻结(0℃以下)和融化(0℃以上)的交替出现。研究表明，采用冻融技术会使土壤颗粒结构发生重新排列，影响土壤的物理和力学性质。本专利技术将此技术应用于破坏未成熟E.tenella的卵囊壁，将卵囊壁的外部结构温度降至0℃以下，使水分结成冰，后长时间将温度维持在0℃以上，卵囊壁表面的冰融化成水，无孔不入的水滴沿着卵囊壁的间隙向内部渗透，反复三次冻融循环产生较大膨胀力，继而破坏卵囊壁的物理结构。未成熟E.tenella卵囊壁有两层，外层为化学成分类似角质蛋白的保护性结构；内层是由合子在发育过程中形成的小颗粒构成，化学成分属于类脂质。采用浓盐酸处理可以让外层的角质蛋白发生部分水解，乙醇处理可溶解内层的部分类脂质，从而破坏卵囊壁的化学结构，但不影响卵囊壁外观形态。本专利技术使用的三次冻融循环+浓盐酸-乙醇水溶液联合处理术，对卵囊壁的破坏率可达到45-50％，增加卵囊壁的通透性，为下一步球虫原生质体染色奠定关键基础。Hoechst33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞毒性较低，常用于普通细胞核的染色，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。荧光染色结果表明，联合处理组卵囊能明显看到细胞膜及卵囊壁完整轮廓，细胞核被特异性染成亮蓝色(见图1)，而正常对照组和仅冻融循环处理组并未看到核浓染(图2、3)。本专利技术首次报道了E.tenella原生质体的染色法，能够捕获染色效果清晰的荧光显微图像。球虫原生质体不容易着色，但本专利技术采用冻融循环和盐酸-乙醇联合处理后，卵囊壁结构中某些成分被破坏从而允许染料进入卵囊并使原生质体着色，该方法能在有效破坏卵囊壁致密组织结构的同时，可完整保存其外形，使Hoechst33258染料更容易通过被破坏卵囊壁的结构间隙渗入卵囊内部，穿透细胞膜，导致原生质体浓染。所以笔者采用此破壁技术实现球虫卵囊内原生质体的荧光染色。技术效果：相对于现有技术，传统的机械研磨破壁方法会使卵囊壁的整体结构完全土崩瓦解并释放出孢子囊，其主要应用于成熟E.tenella孢子化卵囊的破壁处理。本研究对未成熟E.tenella卵囊进行冻融循环和盐酸-乙醇联合处理，成功建立了未成熟E.tenella卵囊的破壁技术，且完好保留卵囊壁的整体形态结构，实现了球虫原生质体的荧光染色，操作简单，方法可信，结果鲜明，易于观察和判断。附图说明图1是冻融循环+盐酸-乙醇处理卵囊的荧光图(激发波长532nm)；图2是仅冻融循环处理卵囊的荧光图(激发波长532nm)；图3是正常球虫卵囊的荧光图(激发波长532nm)；具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步详细地说明：实施例1(1)取球虫感染鸡后从盲肠中分离的新鲜未成熟柔嫩艾美耳球虫卵囊，用20％的次氯酸钠溶液，4℃冰箱作用10min，用灭菌水离心洗涤3次以除去次氯酸钠。最后一次沉淀物中加入1.1mol/L的蔗糖溶液，2000rpm离心10min，漂浮卵囊，吸取卵囊于另一离心管中，用灭菌水洗涤3次，以除去蔗糖。(2)将纯化好的未成熟柔嫩艾美耳球虫卵囊分别置于4℃和-20℃条件下15min，冻融循环三次；(3)采用37％浓盐酸-95％乙醇水溶液(体积比为1:1)处理冻融循环后的未成熟柔嫩艾美耳球虫卵囊，在4℃条件下作用4h后，离心去除作用液，蒸馏水洗涤3次，调整卵囊浓度为1×103个/μl；(4)在含有上述处理卵囊的Eppendorf管中加入Hoechst33258染料，调整其终浓度为1μg/ml；(5)在激发波长532nm下，采用荧光倒置显微镜暗视野聚光器，在暗视野下观察卵囊内原生质体的染色特性。荧光结果显示，正常球虫和仅冻融循环处理组卵囊内原生质体没有被着色(见图2、3)，而冻融循环和盐酸-乙醇处理组卵囊能明显看到原生质体被特异性染成亮蓝色(如图1所示)，这说明冻融循环和盐酸-乙醇联合处理可破坏卵囊壁致密的组织结构，增加卵囊壁通透性，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种柔嫩艾美耳球虫原生质体的染色方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)取新鲜分离的未成熟柔嫩艾美耳球虫卵囊，冻融循环；/n(2)采用盐酸-乙醇水溶液处理冻融循环后的卵囊，作用后，离心洗涤去除作用液；/n(3)加入染料，进行柔嫩艾美耳球虫原生质体的荧光染色。/n

【技术特征摘要】
1.一种柔嫩艾美耳球虫原生质体的染色方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取新鲜分离的未成熟柔嫩艾美耳球虫卵囊，冻融循环；
(2)采用盐酸-乙醇水溶液处理冻融循环后的卵囊，作用后，离心洗涤去除作用液；
(3)加入染料，进行柔嫩艾美耳球虫原生质体的荧光染色。


2.根据权利要求1所述的一种柔嫩艾美耳球虫原生质体的染色方法，其特征在于，所述冻融循环是分别置于4℃和-20℃条件下，每次作用时间为14-16min。


3.根据权利要求1所述的一种柔嫩艾美耳球虫原生质体的染色方法，其特征在于，所述盐酸是浓度为36～38％的浓盐酸，所述乙醇为93-97％的乙醇水溶液，盐酸-乙醇水溶液的体积比为1:(0.5-1....

【专利技术属性】
技术研发人员：李金贵，邢涛，陈许乐，郁星星，伯若楠，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32