本发明专利技术涉及一种基于双香豆素衍生物的过氧化亚硝酸盐荧光探针、制备方法与应用。具体地，本发明专利技术的探针是一类基于双香豆素衍生物的荧光探针，可作为过氧化亚硝酸盐荧光探针，用于测量、检测或筛选过氧化亚硝酸盐及活细胞荧光成像。这类探针可实现如下技术效果中的至少一个：高选择性识别过氧化亚硝酸盐、可以快速对过氧化亚硝酸盐实现响应、可以实现对过氧化亚硝酸盐的超灵敏分析、可生理水平条件下检测过氧化亚硝酸盐、具有较强的抗干扰能力、合成简单以及性质稳定。
A peroxynitrite fluorescent probe based on dicoumarin derivatives, its preparation and Application
【技术实现步骤摘要】
一种基于双香豆素衍生物的过氧化亚硝酸盐荧光探针、制备方法与应用
本专利技术属于荧光探针领域，具体涉及一种基于双香豆素衍生物的过氧化亚硝酸盐荧光探针及其在测量、检测或筛选过氧化亚硝酸盐及活细胞荧光成像方法中的应用；本专利技术还提供了制备所述荧光探针的方法。
技术介绍
过氧化亚硝酸盐是一种典型的活性氧/氮物种，它是由一氧化氮和超氧自由基快速反应而生成，在生理条件下其半衰期很短。由于过氧亚硝酸盐具有强大的氧化能力和硝化能力，它在许多生理过程和病理过程中起着关键作用。例如，过氧化亚硝酸盐在细胞信号转导通路中起着重要的作用，但是，由于其强大的氧化、硝化能力，过氧化亚硝酸盐也会对细胞中许多生物大分子造成损害，例如DNA和蛋白质。此外，当过氧化亚硝酸盐的浓度异常时，会导致许多疾病，如心血管疾病和损伤、阿尔茨海默氏病、自身免疫，甚至癌症。相关研究进一步表明，过氧化亚硝酸盐的过量生产与癌变之间存在重要的联系，这些发现都可以表明过氧化亚硝酸盐可能具有双重的生理和病理作用。鉴于此，发展能够有效在生理水平条件下检测过氧化亚硝酸盐的分析方法是极其重要和有意义的。在这些众多的检测方法中荧光探针由于其特有的优点而成为研究人员关注的焦点。然而，目前报道的荧光探针仍存在一些问题，包括选择性不够好、响应速度不够快、合成复杂、灵敏度不高等，并且由于生命体内的其他物质会对过氧化亚硝酸盐的检测构成潜在干扰。因此，发展快速，高选择性、高灵敏度、合成简单的过氧化亚硝酸盐荧光探针成为本领域技术人员亟待解决的课题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是在于提供一类制备简单的快速超灵敏高选择性过氧化亚硝酸盐的荧光探针，以及它们的制备方法和用途，具有合成简单、选择性好、灵敏度高的特点，并且能够在生理水平条件下对过氧化亚硝酸盐进行有效测量、检测或筛选。具体而言，本专利技术提供了一种化合物，具有式(I)所示的结构：式(I)中，R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基和羧基组成的组；且其中的R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7可以相同或不同。在本专利技术的一些具体实施方案中，本专利技术的化合物是R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7均为氢原子的式(I)化合物，其结构式如下：本专利技术还提供了式(I)化合物的制备方法，包括如下步骤：使式(III)化合物与4-(溴甲基)苯硼酸频哪醇酯反应制备得式(I)化合物，其反应式如下：式(I)和(III)中：R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基和羧基组成的组；且其中的R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7可以相同或不同。具体而言，将式(III)化合物(双香豆素类荧光团类化合物)与4-(溴甲基)苯硼酸频哪醇酯溶于二甲基甲酰胺中，常温反应，待反应完毕后，减压旋蒸干有机溶剂，从而获得含有式(I)化合物化合物的粗产物。粗产品进一步通过色谱柱进行分离，二氯甲烷和甲醇的混合溶剂为洗脱剂，可得到纯净的式(I)化合物。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述式(III)化合物与对4-(溴甲基)苯硼酸频哪醇酯的摩尔比为1:1-1:1.5。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述反应时间为5-24小时。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述洗脱剂中，二氯甲烷和甲醇的的体积比为100:1。本专利技术还提供了用于测量、检测或筛选过氧化亚硝酸盐的荧光探针组合物，其包含本专利技术的所述式(I)化合物。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述式(I)化合物具有以下结构：在本专利技术的一些具体实施方案中，所述荧光探针组合物进一步包含溶剂、酸、碱、缓冲溶液或其组合。本专利技术还提供了检测样品中过氧化亚硝酸盐的存在或测定样品中的过氧化亚硝酸盐含量的方法，其包括：a)使所述式(I)或式(Ⅱ)化合物与样品接触以形成荧光化合物；b)测定所述荧光化合物的荧光性质。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述样品是化学样品或生物样品。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述样品是包括水、血液、微生物或者动物细胞或组织在内的生物样品。本专利技术还提供了检测样品中过氧化亚硝酸盐的存在或测定样品中的过氧化亚硝酸盐含量的试剂盒，其包含所述式(I)或式(II)化合物。本专利技术还提供了所述式(I)或式(II)化合物在细胞荧光成像中的应用。本专利技术相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：(1)选择性高，抗干扰能力强本专利技术的过氧化亚硝酸盐荧光探针可选择性的与过氧化亚硝酸盐发生特异性反应，生成荧光变化的产物，相较于常见的其他金属离子及生命体内的其他物质，包括但不限于钾离子、钠离子、亚铁离子、铁离子、钙离子、硫离子、氯离子、氟离子、溴离子、硫酸根、硝酸根离子、亚硝酸根离子、碳酸根离子、丙氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽、过氧化氢、羟基自由基、过氧化叔丁醇、超氧阴离子、单线态氧、一氧化氮、次氯酸等，本专利技术荧光探针显示出了较高的选择性，并且抗干扰能力强。(2)灵敏度高本专利技术的过氧化亚硝酸盐荧光探针与过氧化亚硝酸盐反应非常灵敏，从而有利于对过氧化亚硝酸盐的检测。(3)可生理水平条件下应用本专利技术的过氧化亚硝酸盐荧光探针可在生理水平条件下应用，并且，生物体内常见的金属离子和其他物质对其干扰较小，可以应用于活细胞荧光成像。(4)稳定性好本专利技术的过氧化亚硝酸盐荧光探针的稳定性好，进而能够长期保存使用。(5)合成简单本专利技术的过氧化亚硝酸盐荧光探针合成简单，有利于商业化的推广应用。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1a是探针(5μM)加入过氧化亚硝酸盐(0-10μM)前后的荧光光谱。图1b是探针定量分析不同浓度过氧化亚硝酸盐(0-0.5μM)的工作曲线。图2是探针(5μM)加入过氧化亚硝酸盐(0.5μM)后，荧光光谱随时间的变化情况。图3不同离子分析物(除特殊表明外，都为100μM)对探针(5μM)的荧光强度的影响。图4是RAW264.7巨噬细胞的共聚焦荧光图像。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行、清楚完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，不应该用来限制本专利技术的保护范围。基于本专利技术中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术的保护范围。实施例1：式(II)化合物的合成合成设计路线如下：实施方案1：将280mg(1m本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.化合物，其具有以下结构：/n
【技术特征摘要】
1.化合物，其具有以下结构：
其中：R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基和羧基组成的组；且其中的R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7可以相同或不同。
2.按照权利要求1的化合物，其特征在于，R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7均为氢原子。
3.一种制备权利要求1或2所述化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：使式(III)化合物与4-(溴甲基)苯硼酸频哪醇酯反应制备得式(I)化合物，其反应式如下：
其中：R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基和羧基组成的组；且其中的R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7可以相同或不同。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将式(III)化合物与4-(溴甲基)苯硼酸频哪醇酯溶于二甲基甲酰胺中，常温反应，待反应完...
【专利技术属性】
技术研发人员：盛文龙，刘可春，靳梦，王雪，陈锡强，王利振，
申请(专利权)人：山东省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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