百子莲胱抑素在提高植物细胞超低温保存后的存活率中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种百子莲胱抑素在提高植物材料超低温保存后的存活率中的应用，所述百子莲胱抑素作为添加剂加入装载液、冷冻保护剂、洗涤液中的至少一种溶液中，由此可提高植物材料玻璃化超低温保存后的存活率，百子莲胚性愈伤组织的存活率由33％提高到80％，拟南芥种子萌发60h幼苗的存活率由30％提高至50％。

Application of cystatin in improving the survival rate of plant cells after cryopreservation

【技术实现步骤摘要】
百子莲胱抑素在提高植物细胞超低温保存后的存活率中的应用
本专利技术涉及生物样本低温或超低温保存
，具体涉及一种百子莲胱抑素在提高植物细胞超低温保存后的存活率中的应用。
技术介绍
超低温保存(Cryopreservation)发展始于上世纪60年代，是指在-80℃及以下温度保存生物材料，由于一般在液氮中保存(-196℃)，也称液氮保存。在液氮中被保存材料细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，处在相对稳定的生物学状态，达到长期保存种质的目的，超低温保存是目前唯一不需要连续继代的中长期保存方式。玻璃化法超低温保存因操作简单快捷，成本低，适宜保存种类广泛，保存材料遗传性稳定，保存效果好等优点，是近十年来用于优良种质资源中长期保存的首选方法。植物玻璃化法超低温保存包括7个主要步骤：预培养(Preculture)、渗透保护(Osmoprotection)、玻璃化溶液脱水(Dehydration)、液氮冷冻(Rapidcooling)、解冻(Rapidwarming)、洗涤(Dilution)和恢复培养(Platingforre-growth)。材料在冻存入液氮前需经过预培养、渗透保护和玻璃化溶液脱水处理。通过玻璃化溶液对植物材料的充分渗透和足够快的降温速率，以提高细胞的粘性，从而抑制冰晶的形成和生长。冻前处理还可以尽可能地降低细胞自由水含量、增加可溶性糖和可溶性蛋白等保护性物质，提高细胞膜在严重脱水条件下的稳定性。解冻时，一般使用快速解冻法，并利用高浓度的蔗糖溶液除去植物材料中的冷冻保护剂成分，如二甲基亚砜等，避免残留的冷冻保护剂对细胞产生抑制和毒害作用，也减轻细胞的质壁复原损伤。恢复培养是将植物材料放置在适宜复苏和生长的环境中进行恢复生长，此阶段的光照、温度、湿度和培养基营养等因素同样会影响植物材料的最终成活率。在植物超低温保存的应用中，仍存在很多关键的技术难题，导致植物材料冻存率低，无法在生产中应用，从而限制了更多的植物被保存应用。胱抑素也称为半胱氨酸蛋白酶抑制剂，是数量最多的半胱氨酸蛋白酶可逆性天然抑制剂，广泛存在于动物、植物和微生物体内，它们与防御机制、保护细胞免受内源或外源不正常的蛋白酶水解的干扰、参与胁迫应激调控等过程密切相关。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种百子莲胱抑素在提高植物细胞超低温保存后的存活率中的应用，以克服现有技术中生物样本超低温保存后存活率低的缺点。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供了一种百子莲胱抑素在提高植物材料超低温保存后的存活率中的应用。优选地，所述百子莲胱抑素作为添加剂加入装载液、冷冻保护剂、洗涤液中的至少一种溶液中。所述百子莲胱抑素的核苷酸序列(SEQIDNO.1)为：ATGCGATCTCAACCGGCGATTTGTTCTCTCGCTCTCGCTCTATTGTTATTTTCAGCGACTTTAGGGTTTCATTCGATCATCGCCATGGCCACGCTCGGAGGCGTTCACGAGAAGGAGGGAACCGAGAACAGCGTCGAGGTCGAGGAGCTCGCTCGTTTCGCTGTCGACGAACACAACAAAAAGGAGAATGCGCTCCTGGAATTTGGACGACTGGTGAAGGCGAAGGAGCAAGTGGTTGCAGGCACCATGTACCATCTGACTGTGGAGGCAATCGAAGCTGGGAAGAAGAAGATCTATGAGGCGAAGGTGTGGGTTAAGCCATGGCTCAACTTCAAGGAGCTTCAGGAGTTTAGGCACGCTGGCGATGCCGACTCTTCTTCCAACATCACCCCTGCGGACCTCGGCGCTAAGCGAGGTGATTGA。所述百子莲胱抑素的蛋白编码序列(SEQIDNO.2)为：MRSQPAICSLALALLLFSATLGFHSIIAMATLGGVHEKEGTENSVEVEELARFAVDEHNKKENALLEFGRLVKAKEQVVAGTMYHLTVEAIEAGKKKIYEAKVWVKPWLNFKELQEFRHAGDADSSSNITPADLGAKRGD。优选地，所述百子莲胱抑素在装载液、冷冻保护剂或洗涤液中的浓度为0.4-1.6mg/L。优选地，所述百子莲胱抑素与磷酸缓冲液混合后加入各溶液中。优选地，所述磷酸缓冲液包括以下含量的各组分：137mMNaCl、2.7mMKCl、10mMNa2HPO4、2mMKH2PO4；所述磷酸缓冲液的pH为7.0～7.8，更优选pH为7.4。优选地，所述百子莲胱抑素利用大肠杆菌Transetta缺陷株进行原核表达获得，所述原核表达的条件为16～25℃、IPTG浓度为0.1～1mM、蛋白表达诱导时间18～24h；蛋白诱导表达后进行GST-tag纯化即得。本专利技术提供了一种提高植物材料超低温保存后的成活率的方法，包括以下步骤：A、将植物材料预处理后，在装载液中浸泡处理；B、将浸泡处理后的植物材料转入冷冻保护剂中，进行脱水处理，然后置于液氮中超低温保存；C、将植物材料从液氮中取出，进行水浴解冻，去除冷冻保护剂后用洗涤液处理；D、去除洗涤液，转入恢复培养基中进行恢复培养；所述装载液、冷冻保护剂、洗涤液中的至少一种溶液含有百子莲胱抑素；所述百子莲胱抑素在装载液、冷冻保护剂或洗涤液中的浓度各为0.4-1.6mg/L。优选地，所述装载液包含以下组分：4.3g/LMS粉、12mol/L丙三醇、0.4mol/L蔗糖和10mmol/LKNO3；所述装载液的pH为5.6～6.2，更优选pH为5.8。优选地，所述冷冻保护剂包含以下组分：2.15g/LMS粉、136.92g/L蔗糖，300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，136.4mL/L二甲基亚砜；所述冷冻保护剂的pH为5.6～6.2，更优选pH为5.8。优选地，所述洗涤液包含以下组分：4.3g/LMS粉、1.2mol/L蔗糖和10mmol/LKNO3；所述洗涤液的pH为5.6～6.2，更优选pH为5.8。优选地，所述MS粉采用以下含量的各组分配制：1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，37.3mg/LNa2-EDTA，27.8mg/LFeSO4·7H2O，100mg/L肌醇，0.5mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1mg/L盐酸硫胺素，2mg/L甘氨酸，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，0.025mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，余量为水。优选地，所述恢复培养基为4.3g/LMS粉、30g/L蔗糖和10g/L琼脂，pH为5.6～本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种百子莲胱抑素在提高植物材料超低温保存后的存活率中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.一种百子莲胱抑素在提高植物材料超低温保存后的存活率中的应用。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述百子莲胱抑素作为添加剂加入装载液、冷冻保护剂、洗涤液中的至少一种溶液中。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述百子莲胱抑素在装载液、冷冻保护剂或洗涤液中的浓度为0.4-1.6mg/L。


4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述百子莲胱抑素与磷酸缓冲液混合后加入各溶液中。


5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述百子莲胱抑素利用大肠杆菌Transetta感受态(北京全式金生物技术有限公司，目录号CD801-01)进行原核表达获得，所述原核表达的条件为16～25℃、IPTG浓度为0.1～1mM、蛋白表达诱导时间18～24h；蛋白诱导表达后进行His-tag纯化即得。


6.一种提高植物材料超低温保存后的成活率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、将植物材料预处理后，在装载液中浸泡处理；
B、将浸泡处理后的植物材料转入冷冻保护剂中，进行脱水处理，然后置于液氮中超低温保存；
C、将植物材料从液氮中取出，进行水浴解冻，去除冷冻保护剂后用洗涤液处理；
D、去除...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈冠群，申晓辉，李蕊莲，黄婷婷，任宁，刘沛林，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31