一种抗葡萄球菌的宽谱噬菌体编码裂解酶及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种抗葡萄球菌的宽谱噬菌体编码裂解酶及制备方法和应用，属于生物技术领域。所述裂解酶核苷酸序列如Seq ID NO.1所示，氨基酸序列如Seq ID NO.2所示；该裂解酶用于防治多种葡萄球菌，该抗葡萄球菌的宽谱噬菌体嵌合裂解酶可以单独或复配使用，或制备成酶制剂，用以防治由葡萄球菌引起的各种污染和感染，特别是奶牛养殖场中由葡萄球菌引起的奶牛乳房炎感染，具有极高的防治效果，且安全无毒副作用。

A broad-spectrum phage coding lyase against Staphylococcus and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种抗葡萄球菌的宽谱噬菌体编码裂解酶及制备方法和应用
本专利技术涉及微生物
，特别是涉及一种抗葡萄球菌的宽谱噬菌体编码裂解酶及制备方法和应用。
技术介绍
葡萄球菌广泛分布于空气、饮水、地面、物体表面及饲料。人及畜禽的皮肤、黏膜、肠道、呼吸道及乳腺也有寄生。致病性葡萄球菌引起各种化脓性感染、败血症及脓毒败血症，污染食品时，可引起食物中毒。根据生化反应和产生色素不同，葡萄球菌属有20多种，其中金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是一种重要的人兽共患病原菌，可以引起伤口感染、心内膜炎、骨髓炎、中毒性休克综合征等多种疾病。除金黄色葡萄球菌外其余种葡萄球菌可以称为凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase-negativestaphyloeocci，CNS)，如：表皮葡萄球菌、模仿葡萄球菌、溶血葡萄球菌、缓慢葡萄球菌等，主要为条件致病菌，引起人和动物持续性感染。葡萄球菌也是感染奶牛乳腺炎的主要致病菌，引起牛奶中体细胞数(Somaticcellcount，SCC)升高，严重影响产奶量及牛奶质量，严重威胁食品安全。金黄色葡萄球菌可引起奶牛乳腺炎，降低奶牛的产奶量和牛奶质量，从而给奶牛养殖行业带来巨大损失。目前，抗生素仍被视为控制奶牛乳腺炎的唯一方法。然而，抗生素的大量使用增强了病原菌的耐受性，尤其在畜禽养殖业中由于抗生素的滥用，导致金黄色葡萄球菌多重耐药性问题日趋严重，特别是对青霉素类药物具有严重的耐受性，最典型的代表是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)。因此寻求一类不易诱导细菌产生耐受性，并且能够高效对抗由耐药金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎的新型抗菌制剂尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗葡萄球菌的宽谱噬菌体编码裂解酶及其制备方法和应用，为控制由耐药性性金黄色葡萄球菌引致的奶牛乳腺炎提供新的抗菌制剂，以实现减量化使用抗生素，为生态养殖提供新策略。为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：本专利技术提供一种抗葡萄球菌的宽谱噬菌体编码裂解酶，其核苷酸序列如SeqIDNO.1所示，氨基酸序列如SeqIDNO.2所示。进一步的，所述裂解酶具有酰胺酶催化结构域和SH3b结合结构域。本专利技术还提供一种所述的裂解酶的制备方法，包括以下步骤：(1)根据裂解酶的基因序列设计引物，并在两条引物的5’端插入pET28a连接接头，进行PCR扩增，反应结束后，将产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并用胶回收试剂盒回收PCR扩增产物；其中，引物序列如下：F：5’-GGTACCCTCGAGGGATCCATGGCTAAGACTCAAGCAGAA-3’；R：5’-CTGCAGGTCGACAAGCTTTTAACTCTTGAATGTCCCCCA-3’；PCR反应体系：引物F2μL，引物R2μL，噬菌体YNP1基因组2μL，PrimeSTARMaxPremix(2×)25μL，去离子水19μL；PCR反应条件：98℃3min；98℃10s，55℃15s，72℃15s，30个循环；72℃5min；(2)将步骤(2)得到的扩增产物连接到质粒载体pET28a，构建裂解酶pET28a表达载体，方法如下：首先将pET28a进行酶切线性化处理，酶切体系：BamHⅠ1μL、HindⅢ1μL、pET28a3μL、10×Buffer5μL、去离子水40μL，30℃15min，37℃20min酶切；随后将1.2.6.1回收的裂解酶基因连接至线性化的pET28a载体，连接体系为：2×HieffCloneEnzymePremix5μL、酶切后pET28a质粒2μL、回收的裂解酶基因1μL、去离子水2μL，50℃连接20min。转至感受态细胞，过夜培养，筛选得到阳性克隆；(3)将阳性克隆接种于含有Kan的LB液体培养基中，摇床培养至对数期，然后加入IPTG，摇床过夜诱导表达，得到发酵液；(4)将诱导后的发酵液进行破碎，用PBS重悬，重悬后的细菌采用超声破碎，破碎后的菌液离心处理，取上清，用0.45μm滤膜过滤后获得裂解酶LysYNP1粗提液。(5)将获得的裂解酶LysYNP1粗提液，采用亲和层析进行纯化，获得纯化的裂解酶LysYNP1。(6)将获得的纯化裂解酶，采用JY-1作为指数菌，测定酶活性效价，确定该酶裂菌活性单位为38μg/ml。本专利技术还提供所述的裂解酶在抑制或杀灭原料乳内葡萄球菌中的应用。本专利技术还提供所述的裂解酶在制备防治牛乳房炎药物中的应用。本专利技术公开了以下技术效果：本专利技术专利技术裂解酶具有高效裂菌特性，平板裂解实验证实该裂解酶能够高效杀死耐药菌株，可用于防治多种葡萄球菌，用以防治由葡萄球菌引起的各种污染和感染，特别是奶牛养殖场中由葡萄球菌引起的奶牛乳房炎感染，具有极高的防治效果，且安全无毒副作用。该抗葡萄球菌的宽谱噬菌体嵌合裂解酶可以单独或复配使用，或制备成酶制剂，用以防治由葡萄球菌引起的各种污染和感染。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为蛋白结构分析，其中A为软件预测裂解酶结构，B为葡萄球菌噬菌体裂解酶的结构；图2为裂解酶LysYNP1蛋白表达的SDS-PAGE分析，M：蛋白质Marker；1:pET28a-LysYNP1诱导后上清；2:pET28a-LysYNP1诱导前；图3为平板裂解实验检测LysYNP1粗提液的裂解活性；图4为小鼠乳腺组织中细菌数量。具体实施方式现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。在不背离本专利技术的范围或精神的情况下，可对本专利技术说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本专利技术的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗葡萄球菌的宽谱噬菌体编码裂解酶，其特征在于，其核苷酸序列如Seq IDNO.1所示，氨基酸序列如Seq ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗葡萄球菌的宽谱噬菌体编码裂解酶，其特征在于，其核苷酸序列如SeqIDNO.1所示，氨基酸序列如SeqIDNO.2所示。


2.一种权利要求1所述的裂解酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据裂解酶的基因序列设计引物，并在两条引物的5’端插入pET28a连接接头，进行PCR扩增，反应结束后，将产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并用胶回收试剂盒回收PCR扩增产物；
(2)将步骤(2)得到的扩增产物连接到质粒载体pET28a，构建裂解酶表达载体pET28a-LysYNP1，转至感受态细胞，过夜培养，筛选得到阳性克隆；
(3)将阳性克隆接种于LB液体培养基中，摇床培养至对数期，然后加入IPTG，摇床过夜诱导表达，得到发酵液；
(4)将诱导后的发酵液进行超声破碎，用PBS重悬，重悬后的细菌采用超声破碎，破碎后的菌液离心处理，取上清，用0.45μm滤膜过滤后获得裂解酶LysYNP1粗提液；
(5)将裂解酶LysYNP1粗提液采用亲和层析纯化，获得纯化的裂解酶LysYNP1。


3.根据权利要求2所述的裂...

【专利技术属性】
技术研发人员：王中华，严亚贤，吴丽飞，王兆飞，陈冈，
申请(专利权)人：王中华，严亚贤，吴丽飞，王兆飞，陈冈，
类型：发明
国别省市：上海;31