一种毛细管表面氨基化方法技术

本发明专利技术公开了一种毛细管表面氨基化方法，包括如下步骤，S1，毛细管预处理使其羟基化；S2，将羟基化处理后的毛细管进行氨基化；S2步骤具体如下，a.经过S1步骤处理后的毛细管加入体积分数为8~12%的APTES(3‑氨丙基三乙氧基硅烷)的乙醇溶液，置于烘箱中60~80℃反应3~5h，然后排掉毛细管内试剂，用无水乙醇洗3~5次，每次浸泡2~4min，吹干；b.加入体积分数为8~12%的MMA（甲基丙烯酸甲酯）的乙醇溶液，置于烘箱中35~45℃反应20~24h，然后排掉毛细管内试剂，用无水乙醇洗3~5次，本发明专利技术提供一种更为安全且高效的方法来实现羟基化过程，用更为绿色的试剂来替换掉氨基化过程中所涉及的有毒有害的甲苯、甲醇；所需的试剂更为简单、安全，操作也更加简便，更加节省时间。

A method of capillary surface amination

【技术实现步骤摘要】
一种毛细管表面氨基化方法
本专利技术涉及一种表面化学蛋白质固定
，具体涉及一种毛细管表面氨基化方法。
技术介绍
生物分子包被固相载体技术在生物学和生物化学的诸多领域都已得到了广泛的应用,其中之一是免疫分析领域，与传统液相吸附和液相沉淀分离方法相比，固相分离技术在免疫分析中具有分离完全、高效和操作简便等特点，一经提出就受到人们的普遍重视，并已成为当前非均相免疫分析最主要和有效的分离手段之一，引用自《免疫分析固相化学偶联技术_徐韬》固相分离技术的关键是选择合适的固相载体以及连接固相和反应物的连接分子，当前使用最广泛的固相材质是聚苯乙烯，但随着科技发展和对技术要求的不断提高，聚苯乙烯作为固相载体的缺点也开始暴露，SCHONE等研究表明，抗原或抗体分子通过疏水作用和固相界面结合后，其分子构象的变化会发生改变，进而影响其生物学性质。且聚苯乙烯作为高聚物，缺乏结构上的刚性，在多种溶剂和反应物中都有一定的溶解度。中国专利技术专利CN101750449A阐述了一种利用物理吸附或是化学键合法在毛细管内部固定一层或多层脂蛋白，该法所制得的脂蛋白毛细管涂层可保留脂蛋白的活性，具有良好的生物相容性，既可用于毛细管表面吸附的抑制和电渗调控，又可作为抗体和药物筛选、临床诊断的测试工具。中国专利技术专利CN102980996B介绍了一种利用毛细管作为反应容器的化学发光免疫分析系统，具有反应体积小，检测速度快等优点。除此之外，毛细管作为固相载体，还具有一定的化学稳定性，基本不溶于有机溶剂的特性。早期以及现在的固相分离技术大多是利用物理吸附原理，使结合标记物仅依靠疏水作用吸附在固相表面，技术也相对成熟，但近年来，随着免疫分析技术的不断发展，越来越多的生物分子很难或者根本不能靠物理作用吸附在固相表面，固相化学偶联技术成为人们新的选择。固相化学偶联技术主要是利用化学或物理方法对固相材料表面进行改性或化学修饰，引入活性基团，再通过合适的化学反应将生物分子通过共价键与固相表面连接。生物分子的固定在很大程度上依赖于基质表面的修饰。随着毛细管表面修饰研究的深入，其中，硅烷氨化是可以引入多种功能基团的最常用的修饰方法。引用自《玻璃珠表面修饰氨基的新型固相合成载体的制备_王洁颖》,常规的毛细管表面氨基修饰可简单分为羟基化、氨基化两个步骤：羟基化，即使毛细管表面暴露或引入更多羟基，以供与后续的硅烷偶联剂反应的过程。可操作的方法有多种，大致可分为两类：一是用酸加热浸泡，常用食人鱼溶液，即浓硫酸（98%）和双氧水（30%）以体积比为7:3（或3:1）的比例配制而成，加热温度为70~80℃，浸泡时间为30min~1h；二是用碱，用碱溶液实现羟基化没有通用的方法，文献中涉及到的有：加入1M氢氧化钾在120℃下活化3h、加入按体积比6:1:1制成的二次去离子水、氨水、和双氧水的溶液加热至80℃并保温5min、加入按体积比1:1:5制成的氨水、双氧水、和二次去离子水的溶液加热至70℃保温30min等。氨基化，即硅烷偶联剂与毛细管表面羟基反应，引入氨基、实现修饰的过程。3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）是最常使用的硅烷偶联剂，经过APTES修饰的毛细管可以用于酶和抗体等生物分子的固定。APTES与毛细管的反应可分为无水和有水两种情况，在无水条件下，硅氧烷键直接与毛细管表面羟基反应实现修饰，硅氧烷键相互之间不会发生反应，APTES分子之间不会缩合，易于实现单分子层的修饰；在有水条件下，由于APTES的水解和自身缩合，在毛细管表面容易形成不规则多分子层，研究中使用较少。为增加毛细管的比表面积，张志胜等将枝形大分子聚酰胺-胺(PAMAM)引入到了毛细管的内壁修饰中，制得了一种高效、稳定且寿命长的毛细管柱。树枝状大分子达到一定的分子代数后表面会产生大量功能性端基，这大大提高了提高毛细管固定生物分子的效率。具体的氨基化过程分为以下三步：一、毛细管经预处理后，通入甲苯冲洗5min，再通入体积分数为10%的APTES的甲苯溶液,然后置于烘箱中,于110℃下恒温4h后，依次用甲苯及甲醇冲洗，制得内壁硅烷化的毛细管；二、通入体积分数为10%的丙烯酸甲酯甲醇溶液,封口,于烘箱中恒温40℃,反应30h后用甲醇冲洗；三、通入体积分数为20%的乙二胺的甲醇溶液,封口,恒温40℃,反应35h后依次用甲醇及水冲洗,得到一代(1G)PAMAM键合的毛细管。重复步骤二、三即可得到多代枝形大分子PAMAM。氨基化修饰完成后，即可利用戊二醛或辛二酸二琥珀酰亚胺酯等偶联剂固定抗体或抗原分子。然而，使用碱溶液进行羟基化没有相对标准的方法，文献中所使用到的碱溶液的种类、比例、反应温度、时间等都不尽相同，有学者在对比浓硫酸、食人鱼溶液、1M氢氧化钠等六种溶液的羟基化作用时发现，1M氢氧化钠的效果明显不如食人鱼溶液。羟基化过程中使用的食人鱼溶液具有极强的腐蚀性，配制时需要佩戴手套，穿戴实验服，于通风橱中进行，增加了操作的难度。且在配制过程中，操作人员需严格遵守将双氧水溶液加入浓硫酸中，顺序不能颠倒，否则因反应过程剧烈放热，高浓度的过氧化氢可能有发生爆炸的危险。郑金颖等在通过测量处理前后二氧化硅表面羟基数的变化时发现，由于浓硫酸与过氧化氢具有强氧化性，可能会破坏二氧化硅表面的结构，从而导致表面羟基数减少。氨基化过程中使用甲苯、甲醇作为溶剂和洗涤液，二者均对中枢神经系统具有麻醉作用，长期接触会给人体带来不可逆的伤害。且甲苯对环境也有严重的危害性，如果处理不当，对空气、水源都会造成污染。因此，需要找到一种更加方便、安全，对人体和环境都友好的方法来实现毛细管的氨基化。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种更为安全且高效的方法来实现羟基化过程，用更为绿色的试剂来替换掉氨基化过程中所涉及的有毒有害的甲苯、甲醇；本专利技术所述方法所需的试剂更为简单、安全，操作也更加简便，更加节省时间。为解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是：一种毛细管表面氨基化方法，包括如下步骤，S1，毛细管预处理使其羟基化；S2，将羟基化处理后的毛细管进行氨基化；其特征在于：S2步骤具体如下，a.经过S1步骤处理后的毛细管加入体积分数为8~12%的APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)的乙醇溶液，置于烘箱中60~80℃反应3~5h，然后排掉毛细管内试剂，用无水乙醇洗3~5次，每次浸泡2~4min，吹干；b.加入体积分数为8~12%的MMA（甲基丙烯酸甲酯）的乙醇溶液，置于烘箱中35~45℃反应20~24h，然后排掉毛细管内试剂，用无水乙醇洗3~5次，每次浸泡2~4min，吹干；c．加入体积分数为15~25%的EDA（乙二胺）的乙醇溶液，置于烘箱中35~45℃反应20~24h，然后排掉毛细管内试剂，用无水乙醇洗3~5次，每次浸泡2~4min，吹干或烘箱中20~30℃过夜烘干。其中，S1具体步骤如下，毛细管中加入灭菌水，超声或上下震动排除管内气泡，确保毛细管中无气泡，然后置于烘箱中90本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种毛细管表面氨基化方法，包括如下步骤，/nS1，毛细管预处理使其羟基化；/nS2，将羟基化处理后的毛细管进行氨基化；/n其特征在于：/nS2步骤具体如下，/na.经过S1步骤处理后的毛细管加入体积分数为8~12%的APTES (3-氨丙基三乙氧基硅烷) 的乙醇溶液，置于烘箱中60~80℃反应3~5h，然后排掉毛细管内试剂，用无水乙醇洗3~5次，每次浸泡2~4min，吹干；/nb. 加入体积分数为8~12%的MMA（甲基丙烯酸甲酯）的乙醇溶液，置于烘箱中35~45℃反应20~24h，然后排掉毛细管内试剂，用无水乙醇洗3~5次，每次浸泡2~4min，吹干；/nc．加入体积分数为15~25%的EDA（乙二胺）的乙醇溶液，置于烘箱中35~45℃反应20~24h，然后排掉毛细管内试剂，用无水乙醇洗3~5次，每次浸泡2~4min，吹干或烘箱中20~30℃过夜烘干。/n

【技术特征摘要】
1.一种毛细管表面氨基化方法，包括如下步骤，
S1，毛细管预处理使其羟基化；
S2，将羟基化处理后的毛细管进行氨基化；
其特征在于：
S2步骤具体如下，
a.经过S1步骤处理后的毛细管加入体积分数为8~12%的APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)的乙醇溶液，置于烘箱中60~80℃反应3~5h，然后排掉毛细管内试剂，用无水乙醇洗3~5次，每次浸泡2~4min，吹干；
b.加入体积分数为8~12%的MMA（甲基丙烯酸甲酯）的乙醇溶液，置于烘箱中35~45℃反应20~24h，然后排掉毛细管内试剂，用无水乙醇洗3~5次，每次浸泡2~4min，吹干；
c．加入体积分数为15~25%的EDA（乙二胺）的乙醇溶液，置于烘箱中35~45℃反应20~24h，然后排掉毛细管内试剂，用无水乙醇洗3~5次，每次浸泡2~4min，吹干或烘箱中20~30℃过夜烘干。


2.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭真真，余建军，韩子华，
申请(专利权)人：成都普利泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51