延龄草总皂苷的提取方法及制药用途技术

本发明专利技术提供一种延龄草总皂苷的提取方法及制药用途。结果表明延龄草总皂苷可以有效抑制结肠癌CT26细胞增殖，其IC

Extraction and pharmaceutical application of total saponins from Trillium

【技术实现步骤摘要】
延龄草总皂苷的提取方法及制药用途
本专利技术涉及一种延龄草总皂苷的提取方法，尤其涉及一种延龄草总皂苷体作为制备治疗结肠癌的药物上的应用。属于生物制药领域。
技术介绍
结肠癌是消化系统中最为常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康。化疗仍是治疗结肠癌的主要手段之一，但化疗药物严重的副作用和多药耐药等问题使其临床应用受到很大的限制。因此寻找能高效杀伤肿瘤细胞同时毒副作用小的药物，是当今抗肿瘤新药研发的热点。延龄草(TrilliumtschnoskiiMaxim)是土家族四大名药之一，其味甘性温，有消痛去肿、止血解毒、安神活血等功效，主治肺痈疮肿、疔疮肿毒、头痛眩晕、神经衰弱等。研究表明，延龄草提取物及皂苷对结肠癌、肺癌、宫颈癌等均有显著抑制作用。RAS是目前所知最保守的癌基因之一，参与细胞生长、增殖、发育及分化调控等重要生理过程，也在细胞恶性转化中起重要作用。RAS蛋白的持续活化可引起细胞快速增殖和抗凋亡信号亢进，由此导致肿瘤发生和发展。HansRaskov等研究发现，结肠癌的发生与K-ras、APC和P53基因突变高度相关。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术采用MTT法、RT-PCR、Westernblotting方法观察延龄草总皂苷对结肠癌CT26细胞增殖以及裸鼠皮下肿瘤抑制的作用以及探讨其发生的作用机制。一种延龄草总皂苷的提取方法，包括如下步骤：取延龄草地珠干燥后粉碎，用乙醇浸泡数小时后，回流提取，减压浓缩提取液，冷冻干燥，得到延龄草总提物；将延龄草总提物加水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，减压浓缩,冷冻干燥，得到萃取物用大孔吸附树脂分离，甲醇洗脱、浓缩干燥，即为延龄草总皂苷。本专利技术的又一技术方案是将所述的提取得到的延龄草总皂苷在制备治疗结肠癌的药物上的应用。作为优选方案，本专利技术将提取得到的延龄草总皂苷在制备抑制结肠癌CT26细胞增殖的药物上的应用。具体是将提取得到的延龄草总皂苷在制备降低Ras、Akt、Erk蛋白及其磷酸化蛋白的表达的药物上的应用。在本专利技术技术方案的基础上，本专利技术的延龄草总皂苷的用量为5mg/kg-15mg/kg。本专利技术体外细胞实验表明延龄草总皂苷对于体外培养的结肠癌CT26细胞的增殖具有抑制作用，IC50值为9.28μg/mL，表明其可能是抗结肠癌的有效成分。体内实验表明延龄草总皂苷有效抑制了裸鼠皮下肿瘤的生长，延龄草总皂苷高、中、低三个浓度也都表现出较好的抑制率，分别为51.22％、34.88％和25.02％，呈浓度依赖趋势。此结果说明延龄草总皂苷体内对肿瘤的生长有抑制效果，与体外细胞实验符合。结肠癌的发生与RAS蛋白的持续活化有关，体内实验瘤组织蛋白水平的结果进一步验证其剂量依赖性作用，而延龄草总皂苷的高、中、低三个剂量组在mRNA水平上均能显著降低RAS基因的表达，而且呈剂量依赖性。因此延龄草总皂苷抑制肿瘤的生长与抑制RAS基因表达或者其下游通道有关联。随后在体外实验中使用Westernblotting方法检测细胞中Ras、Akt、Erk蛋白及其磷酸化蛋白的表达水平进一步证实其作用机制，发现Ras、Akt、Erk蛋白表达水平呈现浓度依赖性降低，并且Akt、Erk同时呈现时间依赖性降低。免疫组化结果同时也说明体内中高剂量组延龄草总皂苷可以促进结肠癌细胞的凋亡。综上所述延龄草总皂苷在体内体外均具有抗肿瘤活性，其机制是通过Ras信号通路干扰Ras、Akt、Erk蛋白的表达。这有望为药物开发提供一个新思路。附图说明图1为RT-PCR法检测延龄草总皂苷对结肠癌瘤组织中RAS基因表达的影响，与模型组比，**P<0.01；n＝8。图2为Westernblotting法检测延龄草总皂苷对结肠癌CT-26细胞Akt、p-Akt、Erk、p-Erk蛋白表达的影响。图3为延龄草总皂苷对结肠癌CT-26细胞Akt、p-Akt、Erk、p-Erk蛋白表达影响的灰度分析统计图，a为延龄草总皂苷对结肠癌CT-26细胞Akt蛋白表达的时间依赖影响，b为延龄草总皂苷对结肠癌CT-26细胞p-Akt蛋白表达的时间依赖影响，c为延龄草总皂苷对结肠癌CT-26细胞Erk蛋白表达的时间依赖影响，d为延龄草总皂苷对结肠癌CT-26细胞p-Erk蛋白表达的时间依赖影响，**P<0.01；n＝3。图4为Westernblotting法检测延龄草总皂苷对结肠癌CT26细胞Ras、Akt、Erk及其磷酸化蛋白表达的浓度依赖性影响。图5为延龄草总皂苷对结肠癌CT26细胞Ras、Akt、Erk及其磷酸化蛋白表达浓度依赖性影响的灰度分析统计图，a为延龄草总皂苷对结肠癌CT26细胞Ras蛋白表达浓度依赖性影响，b为延龄草总皂苷对结肠癌CT26细胞p-Ras浓度依赖性影响，c为延龄草总皂苷对结肠癌CT26细胞Akt浓度依赖性影响，d为延龄草总皂苷对结肠癌CT26细胞p-Akt浓度依赖性影响，e为延龄草总皂苷对结肠癌CT26细胞Erk浓度依赖性影响，f为延龄草总皂苷对结肠癌CT26细胞p-Erk浓度依赖性影响；*P<0.05，**P<0.01；n＝3。图6延龄草总苷作用肿瘤组织HE染色结果，a为模型组，b为高剂量组，c为中剂量组，d为低剂量组。图7为Westernblotting法检测延龄草总苷作用肿瘤组织对Ras蛋白表达水平的影响。图8为延龄草总苷作用肿瘤组织对Ras蛋白表达水平影响的灰度分析统计图，*P<0.05，**P<0.01；n＝3。具体实施方式实施例1药物与试剂本专利技术所用中药延龄草采摘于神农架林区，经三峡大学中药药理三级实验室鉴定为延龄草。人结肠癌细胞株CT26由上海柯雷生物技术公司提供。1640培养基、胰蛋白酶、PBS购于Hyclone公司，胎牛血清购于武汉赛普诺生物科技有限公司，二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑盐(MTT)均购于Sigma公司；β-actin抗体、Ras抗体、磷酸化Ras抗体、Akt抗体、磷酸化Akt抗体、Erk抗体、磷酸化Erk抗体购于美国CST公司。甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂购于湖北泽川科技有限公司。本专利技术所用仪器包括：EYELAN-1100型旋转蒸发仪：上海爱郎仪器有限公司；电子天平：上海天平仪器厂；Thermo全波长酶标仪：ThermoElectron公司；MCD175型CO2培养箱：日本SANYO公司；Eppendorfcentrifuge5804R型低温高速离心机：德国Eppendorf公司；超净台：苏州安泰空气技术有限公司；微型瞬时离心机：美国BIO-BAD生物公司；免疫印迹仪，凝胶成像仪购于Bio-Rad公司。瘤株鼠CT26细胞购于上海柯雷生物技术有限公司BALB/c-nu雌性小鼠在三峡大学动物实验中心饲养延龄草总皂苷的制备取延龄草地珠于48℃恒温烘箱中干燥，用中药粉碎机粉碎后过60目筛，用乙醇浸泡数小时后，回流提取，反复多次，减压浓缩本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.延龄草总皂苷的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：取延龄草地珠干燥后粉碎，用乙醇浸泡数小时后，回流提取，减压浓缩提取液，冷冻干燥，得到延龄草总提物；/n将延龄草总提物加水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，减压浓缩,冷冻干燥，得到萃取物用大孔吸附树脂分离，甲醇洗脱、浓缩干燥，即为延龄草总皂苷。/n

【技术特征摘要】
1.延龄草总皂苷的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：取延龄草地珠干燥后粉碎，用乙醇浸泡数小时后，回流提取，减压浓缩提取液，冷冻干燥，得到延龄草总提物；
将延龄草总提物加水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，减压浓缩,冷冻干燥，得到萃取物用大孔吸附树脂分离，甲醇洗脱、浓缩干燥，即为延龄草总皂苷。


2.根据权利要求1所述的提取得到的延龄草总皂苷在制备治疗结肠癌的药物上的应用。

【专利技术属性】
技术研发人员：喻玲玲，邹坤，陈静文，陈先勇，蒋安蓉，李世刚，柳蔚，
申请(专利权)人：三峡大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42