一种血清中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种血清中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的检测方法及试剂盒，涉及免疫抑制剂的检测技术领域。本发明专利技术将待测样品预处理后，进行固相支持液‑液萃取，然后用高效液相色谱法检测，具有样品用量少、操作简便、重现性好、回收率高等优点。同时，利用血清中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的检测方法制备的试剂盒具备操作简便快速、检测成本低、特异性高等优点，可弥补市场现有产品的不足。

A test method and kit for mycophenolate mofetil, mycophenolic acid and their metabolites in serum

【技术实现步骤摘要】
一种血清中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的检测方法及试剂盒
本专利技术涉及免疫抑制剂的检测
，具体涉及一种霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的检测方法及试剂盒。
技术介绍
霉酚酸酯(MMF)是一种新型的免疫抑制剂，由瑞士罗氏(Roche)制药有限公司开发，1995年8月首次在美国上市。MMF作为前体药物，口服后在体内代谢为活性产物霉酚酸(MPA)，MPA可抑制T、B淋巴细胞中的嘌呤的合成来减少免疫活性淋巴细胞进而抑制排斥反应。MPA在体内部分代谢为酚化葡萄糖醛麦考酚酸(MPAG)，MPAG无药理作用，可被分泌入胆汁并进入小肠，经肠道作用再次分解为MPA。目前临床以常规剂量用于急性抗排斥反应，由于MPA的血药浓度具有个体差异性，所以会产生疗效的差异性，严重甚至于不良反应的发生。因此通过监测MPA和MPAG的血药浓度，及时调整MMF的给药量，减少不良反应，为达到最佳疗效是十分必要的。目前，有关霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的血药浓度测定方法主要包括免疫法、色谱法。免疫法目前在国内尚无试剂盒的供应，不能作为霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物血药浓度监测的常规方法。色谱法为常用方法，但在色谱检测前需要对样品进行处理，目前比较常见的处理方法为将蛋白沉淀去除后进行色谱检测，该方法只能将血清中的蛋白除去，未能将血液成分中其他干扰杂质除去，难以对霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物进行准确检测。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种血清中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的检测方法及试剂盒，具有样品用量少、操作简便、重现性好、回收率高等优点。同时，利用血清中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的检测方法制备的试剂盒具备操作简便快速、检测成本低、特异性高等优点，可弥补市场现有产品的不足。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：一种血清中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的检测方法，待测样品预处理后，进行固相支持液-液萃取，然后用高效液相色谱法检测。进一步的技术方案在于，固相支持液-液萃取为将预处理后样品上样到固相支持液-液萃取板上，静置，再用洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，吹干。进一步的技术方案在于，所述固相支持液-液萃取板为96孔板，静置时间为10-30min，洗脱剂为甲基叔丁基醚和乙酸乙酯的混合溶剂，洗脱为在重力作用下进行洗脱，吹干采用45℃氮气吹干。进一步的技术方案在于，所述甲基叔丁基醚和乙酸乙酯的混合溶剂中甲基叔丁基醚和乙酸乙酯的体积比为3:1。进一步的技术方案在于，所述预处理为向待测样品中加入蛋白沉淀剂，震荡混匀，离心。进一步的技术方案在于，所述蛋白沉淀剂为乙腈，乙腈与待测样品的体积比为0.5-1:1。进一步的技术方案在于，所述高效液相色谱法检测条件如下：以甲醇-磷酸二氢钠为流动相，色谱柱为C18柱，流动相流速为1mL/min，柱温为45℃。进一步的技术方案在于，流动相中甲醇和磷酸二氢钠体积比为55:45，用磷酸调节流动相pH至3.0。另外，本专利技术提供一种血清中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的检测试剂盒，如表1：采用上述技术方案所产生的有益效果在于：旨在采用固相支持液-液萃取对目标物进行富集和纯化，进而进行高效液相色谱检测。固相支持液-液萃取在传统液-液萃取法的基础上，采用硅藻土为吸附剂，利用硅藻土吸水性强、性质稳定的特点，快速吸附样品基质中的水分，在吸附剂表面形成液膜，使霉酚酸和水相分离，实现对霉酚酸的富集与纯化。同时，利用乙腈为蛋白沉淀剂，蛋白去除率达90％以上。高效液相色谱检测时选用甲醇-磷酸二氢钠为流动相，并且用磷酸调节流动相pH至3.0，保证了霉酚酸(MPA)与霉酚酸酯(MMF)、酚化葡萄糖醛麦考酚酸(MPAG)具有良好的分离度。该方法具有样品用量少、操作简便、重现性好、回收率高等优点。利用血清中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物检测方法制备得到的试剂盒具备操作简便快速、检测成本低、特异性高等优点，在生物检测领域中有极大的应用，可弥补市场现有产品的不足，满足临床检测的需求。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1为本专利技术的标准物质(在甲醇中)的色谱图；图2为本专利技术的空白血清的色谱图；图3为本专利技术的标准物质(在血清中)的色谱图；图4为本专利技术的病人血清的色谱图；图5为本专利技术的霉酚酸(MPA)的标准曲线；图6为本专利技术的霉酚酸酯(MMF)的标准曲线；图7为本专利技术的酚化葡萄糖醛麦考酚酸(MPAG)的标准曲线。具体实施方式下面结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术，但是本专利技术还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似推广，因此本专利技术不受下面公开的具体实施例的限制。本专利技术公开了一种血清中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的检测方法，待测样品预处理后，进行固相支持液-液萃取，然后用高效液相色谱法检测。本专利技术优选实施例中，固相支持液-液萃取为将预处理后样品上样到固相支持液-液萃取板上，静置，再用洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，吹干。本专利技术优选实施例中，所述固相支持液-液萃取板为96孔板，静置时间为10-30min，洗脱剂为甲基叔丁基醚和乙酸乙酯的混合溶剂，洗脱为在重力作用下进行洗脱，吹干采用45℃氮气吹干。本专利技术优选实施例中，所述甲基叔丁基醚和乙酸乙酯的混合溶剂中甲基叔丁基醚和乙酸乙酯的体积比为3:1。本专利技术优选实施例中，所述预处理为向待测样品中加入蛋白沉淀剂，震荡混匀，离心。本专利技术优选实施例中，所述蛋白沉淀剂为乙腈，乙腈与待测样品的体积比为0.5-1:1。本专利技术优选实施例中，所述高效液相色谱法检测条件如下：以甲醇-磷酸二氢钠为流动相，色谱柱为C18柱，流动相流速为1mL/min,柱温为45℃。本专利技术优选实施例中，流动相中甲醇和磷酸二氢钠体积比为55:45，用磷酸调节流动相pH至3.0。另外，本专利技术还公开了一种血清中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的检测试剂盒：实施例一本实施例为患者血清中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的测定，检测方法如下：一、溶液配制1、储备液配制精密称取霉酚酸酯10.00mg于25mL容量瓶中，用甲醇定容为浓度400mg/L的标准储备液；取1mg/mL的霉酚酸于10mL容量瓶中加入乙腈定容为浓度100mg/L的标准储备液；精密称取酚化葡萄糖醛麦考酚酸1.00mg于10mL容量瓶中定容为浓度100mg/L的标准储备液。精密称取卡马西平10.00mg于10mL容量瓶中，用甲醇定容为浓度1000mg/L本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种血清中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的检测方法，其特征在于，待测样品预处理后，进行固相支持液-液萃取，然后用高效液相色谱法检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种血清中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的检测方法，其特征在于，待测样品预处理后，进行固相支持液-液萃取，然后用高效液相色谱法检测。


2.根据权利要求1所述的一种血清中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的检测方法，其特征在于，固相支持液-液萃取为将预处理后样品上样到固相支持液-液萃取板上，静置，再用洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，吹干。


3.根据权利要求2所述的一种血清中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的检测方法，其特征在于，所述固相支持液-液萃取板为96孔板，静置时间为10-30min，洗脱剂为甲基叔丁基醚和乙酸乙酯的混合溶剂，洗脱为在重力作用下进行洗脱，吹干采用45℃氮气吹干。


4.根据权利要求3所述的一种血清中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的检测方法，其特征在于，所述甲基叔丁基醚和乙酸乙酯的混合溶剂中甲基叔丁基醚和乙酸乙酯的体积比为3:1。


5.根据权利要求1-4任一项权利要求所述的一种血清中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的检...

【专利技术属性】
技术研发人员：李挥，王丽，周丽，杨光，刘若锦，哈婧，崔浩亮，
申请(专利权)人：河北省医疗器械与药品包装材料检验研究院河北省医疗器械技术审评中心，
类型：发明
国别省市：河北;13