微生物传感器及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供高通透电化学微生物传感器及其制备方法和应用，其中制备步骤包括：S1制备菌液；S2油包水型高内相乳液的制备；S3微生物传感器制备。该生物传感器采用三电极线性循环伏安法检测不同浓度的甲基磺草酮溶液的电化学行为来分析甲基磺草酮对两种不同细菌的急性生物毒性结果进而使实现其应用。通过该方法得到的微生物传感器，检测快速灵敏，可反映不同毒性物质浓度下微生物的应激电流响应。

Microbial sensor and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
微生物传感器及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物传感器电化学领域，具体涉及微生物传感器及其制备方法和应用。
技术介绍
农业科技的进步离不开农药的大规模使用。近年来，农药对环境污染的影响，特别是通过土壤经雨淋而后到河流、湖泊等天然水体，从而影响大范围人群的健康问题而日益引起人们的重视。目前在各大水体和沉积物中已监测到了有机氯、有机磷、三唑类和拟除虫菊酯类等多种农药。这些农药通过水生生物体富集、再通过食物链传递进而危害人类的健康。然而，许多农药及其代谢产物的毒性和对环境的影响在使用多年后才被认识到或尚未被完全评估出来。例如1957年专利技术的莠去津(2-氯-4-二乙胺基-6-异丙胺基-1，3，5-三嗪，阿特拉津，atrazine)，是世界上最大的除草剂农药品种。经多年研究发现，莠去津的脱氯与烷基代谢产物会造成严重的地下水体污染，其在环境中的积累30年后仍然可被测出。而在2017年10月莠去津才被世卫组织列为3类致癌物，在欧洲已被禁用。于2000年注册的甲基磺草酮(2-(4-甲磺酰基-2-硝基-苯甲酰基)环己烷-1,3-二酮)是莠去津的替代农药，被认为是一种安全的除草剂，用量在近年来快速增加。甲基磺草酮可通过光、植物代谢、土壤微生物代谢、芬顿反应等方式降解。然而，近来的研究表明，甲基磺草酮会造成鱼体DNA损伤，对微生物酯酶有毒性作用，其代谢产物(主要是4-甲砜基-2-硝基苯甲酸，MNBA和2-氨基-4-甲砜基苯甲酸，AMBA)的毒性更强。长期食用含有甲基磺草酮残留的食物会对人畜产生致癌作用，或引起胎儿畸形。这些研究的出现对深入了解甲基磺草酮对环境和生物体的影响至关重要，但所用方法复杂，涉及仪器(高效液相色谱-质谱等)昂贵，处理样品耗时长、分析条件苛刻。因此建立快速测定甲基磺草酮的生物毒性的方法有其迫切性和必要性。农药的生物毒性可以从对微生物的毒性，最初通过在不同浓度的所测农药的培养基中通过培养微生物数量来反映。但这种做法耗时很长，因细菌多样性、突变性、驯化或菌株感染等因素导致其结果重现性不佳。同时，反映不出引起不同微生物生长结果的影响机理。生物传感器是20世纪60年代发展起来的，由生物或生物有关的敏感元件和物理化学传感器(换能器)相结合，提供定量或半定量分析信息的小型分析仪器。其中利用全细胞微生物作为生物传感器的敏感元件具有制备容易、成本低、检测重现性好、使用寿命长、不易失活等优点。但当前微生物传感器面临的主要问题有用于固定微生物的载体膜制备工艺复杂，测试时膜阻力大，影响被测物质和营养物质在膜中的扩散，测量时间长，影响测量效率和结果准确性等。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题鉴于以上所述，本专利技术的目的之一在于提供微生物传感器的制备方法，以微生物为载体匹配特制电极来构建微生物传感器。本专利技术的另一个目的在于提供该微生物传感器在生物毒性测量方面的应用。本专利技术的第三个目的在于提供该微生物传感器对水体中甲基磺草酮的生物毒性快速测定方法。(二)技术方案为解决所述技术问题，本专利技术提供微生物传感器的制备方法，包括以下步骤：S1、制备菌液，以土壤细菌胶质芽孢杆菌和大肠杆菌为载体通过培养及后处理工序制备菌液；S2、制备油包水型高内相乳液，以苯乙烯-二甲基丙烯酸乙二醇酯为油相，以Span80-Tween80为乳化剂体系，以过硫酸铵-亚硫酸氢钠为引发剂体系，以后处理的菌液为水相制备油包水型高内相乳液；S3、制备微生物传感器，将含细菌的稳定的高内相乳液滴加在处理过的电极表面，于37℃烘干，制备微生物传感器。上述S1步骤中制备菌液的具体方法包括以下步骤：A1、在琼脂培养基上分别纯化胶质芽孢杆菌和大肠杆菌，取样接种于各自液体培养基；A2、在对数生长期时取出，离心分离菌体，用0.85％NaCl溶液洗涤并重新离心分离；A3、用分散液调整光密度值，便制备而得用于高内相乳液水相的菌液。其中，在上述方法中大肠杆菌的培养基为本领域所公知的培养基，为LB培养基、SOB培养基以及SOC培养基，优选LB培养基；胶质芽孢杆菌培养基为适合菌体繁殖生长的含氮培养基，其1L培养基的配方为：蔗糖5-10g，K2HPO42-5g，MgSO4·7H2O1.4-5g，CaCO32-10g，酵母2g，(NH4)2SO40.5-2.5g，FeCl3·6H2O0.01-0.05g，NaCl0.2g。优选培养基配方为：蔗糖7g，K2HPO43g，MgSO4·7H2O2.5g，CaCO36g，酵母2g，(NH4)2SO41.0g，FeCl3·6H2O0.03g，NaCl0.2g。进一步地，胶质芽孢杆菌和大肠杆菌的培养条件都为37℃16-32h，优选24h菌液。进一步地，调整菌液光密度的分散液为其液体培养基或0.85％NaCl溶液，优选0.85％NaCl溶液。上述S2步骤中的油包水型高内相乳液选取苯乙烯和二甲基丙烯酸乙二醇酯为油相，其比例为1-7.5:1(W/W)，优选为4:1；而乳化剂的总重量占油相比重在8-20％，优选11％；Span80和Tween80的重量比例为7-15:1，优选12.75:1；过硫酸铵和亚硫酸氢钠的量为1:1(W/W)，总重为水相重量的1.5-3％，优选2％；油相和水相的比例为1:3-9，优选1:4-7。上述S3步骤中的电极为玻碳电极或铂片电极，优选玻碳电极。上述电极处理方法，包括以下步骤：B1、将玻碳电极用0.05μm的Al2O3粉末进行抛光；B2、用二次水超声清洗5分钟，再用乙醇超声清洗5分钟，最后用二次水超声清洗5分钟；B3、清洗好的电极吹干即可。上述S3步骤中高内相乳液滴至电极表面时滴加的量为20-50μL，优选30μL；且在37℃真空烘半小时至四小时，优选1小时。本专利技术的第三目的在于提供水体中甲基磺草酮的生物毒性快速测定方法，包括以下步骤：C1、制备适合微生物的呼吸基质、电子媒介体和甲基磺草酮标准溶液；C2、细菌活化：将所得微生物传感器浸泡入呼吸基质30min，而后用去离子水冲洗，晾干；C3、加入呼吸基质，搭建三电极体系，稳定一段时间，设定电化学测试条件，进行检测；C4、加入一定量的电子媒介体，搅拌一段时间，进行检测；C5、加入不同量的甲基磺草酮标准溶液，搅拌一段时间，进行检测。所述微生物呼吸基质可指葡萄糖呼吸基质(0.85％NaCl,10mM葡萄糖，10mM丁二酸钠，10mM乳酸钠，pH＝7.0)或直接是0.85％NaCl溶液，优选0.85％NaCl；所取量为5-20mL，优选15mL；稳定时间可选取5-30min，优选15min。所述电子媒介体为对苯醌或铁氰化钾，优选对苯醌；配制对苯醌浓度为6.48g/L，加入到呼吸基质中，使最终浓度在0.2-1.2mM之间，优选0.4mM；搅拌时间可选取5-30min，优选10min。所述甲基磺草酮标准溶液的配制是指配制1g/L或10g/L甲基磺草酮的乙腈溶液100mL，加入到本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.微生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、制备菌液，以土壤细菌胶质芽孢杆菌和大肠杆菌为载体通过培养及后处理工序制备菌液；/nS2、制备油包水型高内相乳液，以苯乙烯-二甲基丙烯酸乙二醇酯为油相，以Span80-Tween80为乳化剂体系，以过硫酸铵-亚硫酸氢钠为引发剂体系，以后处理的菌液为水相制备油包水型高内相乳液；/nS3、制备微生物传感器，将含细菌的稳定的高内相乳液滴加在处理过的电极表面，于37℃烘干，制备微生物传感器。/n

【技术特征摘要】
1.微生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备菌液，以土壤细菌胶质芽孢杆菌和大肠杆菌为载体通过培养及后处理工序制备菌液；
S2、制备油包水型高内相乳液，以苯乙烯-二甲基丙烯酸乙二醇酯为油相，以Span80-Tween80为乳化剂体系，以过硫酸铵-亚硫酸氢钠为引发剂体系，以后处理的菌液为水相制备油包水型高内相乳液；
S3、制备微生物传感器，将含细菌的稳定的高内相乳液滴加在处理过的电极表面，于37℃烘干，制备微生物传感器。


2.根据权利要求1所述的微生物传感器的制备方法，其特征在于，S1步骤中制备菌液的具体方法包括以下步骤：
A1、在琼脂培养基上分别纯化胶质芽孢杆菌和大肠杆菌，取样接种于各自液体培养基；
A2、在对数生长期时取出，离心分离菌体，用0.85%NaCl溶液洗涤并重新离心分离；
A3、用分散液调整光密度值，便制备而得用于高内相乳液水相的菌液。


3.根据权利要求2所述的微生物传感器的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌的培养基为本领域所公知的培养基，为LB培养基、SOB培养基以及SOC培养基其中一种；胶质芽孢杆菌培养基为适合菌体繁殖生长的含氮培养基，其1L培养基的配方为：蔗糖5-10g，K2HPO42-5g，MgSO4·7H2O1.4-5g，CaCO32-10g，酵母2g，(NH4)2SO40.5-2.5g，FeCl3·6H2O0.01-0.05g，NaCl0.2g。


4.根据权利要求3所述的微生物传感器的制备方法，其特征在于，胶质芽孢杆菌和大肠杆菌的培养条件都为37℃16-32h，其中调整菌液光密度的分散液为其液体培养基或0.85%NaCl溶液。


5.根据权利要求1所述的微生物传感器的制备方法，其特征在于，S2步骤中的油包水型高内相乳液选取苯乙烯和二甲...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐雅玲，屠晓华，李加友，于建兴，张洋，缪程平，
申请(专利权)人：嘉兴学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33