一种纳米杂化丝素蛋白水凝胶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种纳米杂化丝素蛋白水凝胶及其制备方法和应用，属于生物医用材料技术领域。本发明专利技术所述的纳米杂化丝素蛋白水凝胶由再生丝素蛋白水溶液与纳米羟基磷灰石通过预共混，经超声处理制备得到。本发明专利技术所述的纳米杂化丝素蛋白水凝胶的制备方法通过改变超声条件和两种材料的混合比例，控制凝胶化时间，实现快速凝胶化，不仅避免了潜在有毒化学交联剂的使用，而且可以很好的保持细胞或者生物因子的活力。本发明专利技术制备出的纳米杂化丝素蛋白水凝胶具有可调控的凝胶性能和机械性能、良好的细胞相容性和骨诱导能力，不仅可以负载干细胞进行骨缺损修复，还有望用于包埋活性因子进行协同治疗。

Nano hybrid silk fibroin hydrogel and preparation method and application thereof

【技术实现步骤摘要】
一种纳米杂化丝素蛋白水凝胶及其制备方法和应用
本专利技术属于生物医用材料
，特别涉及一种纳米杂化丝素蛋白水凝胶及其制备方法和应用。
技术介绍
再生丝素蛋白是由桑蚕茧中提取的动物来源蛋白，具有资源丰富、低免疫性、可调的生物降解性能和良好的血液相容性等优点，是在骨缺损修复领域颇有应用前景的天然材料。由于桑蚕丝蛋白不同于柞蚕丝素蛋白，其本身没有用于细胞识别的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)短肽序列，因此增加桑蚕丝生物材料的细胞响应性是其应用于组织工程领域的要点之一。人工合成的纳米级羟基磷灰石(nHA)与自然骨的无机成分有相近的矿物相组成和晶体结构，研究表明纳米级羟基磷灰石具有增加成骨细胞黏附和蛋白附着的能力，将桑蚕丝素蛋白与其复合制备用于组织工程修复支架是实现骨再生的研究热点。然而目前公布的制备羟基磷灰石/再生丝素蛋白杂化材料往往存在支架要预先成型的问题，难以适应不规则的骨缺损部位，如专利CN200610009993.4公开的“纳米羟基磷灰石/丝素蛋白-壳聚糖复合支架及其制备方法”和专利CN102085391A公开的“羟基磷灰石/壳聚糖-丝素蛋白纳米复合材料及制备方法”，都是先制备成一定形状的支架，在临床上使用不方便。在骨缺损修复的领域，一个发展趋势是开发新型的负载多功能干细胞的可注射水凝胶。丝素蛋白水凝胶具有含水量高、结构与细胞外基质类似、生物相容性好、可生物降解、力学性能良好等特点，在药物缓释、细胞培养、组织工程等生物医用领域得到了广泛应用。但传统的丝素蛋白水凝胶往往具有以下缺点：一、凝胶化时间过长，一般凝胶化时间在几天到几周不等，限制其在临床上的应用；二、形成凝胶需要加入交联剂或离子盐等，如专利CN103965491A公开的“一种丝素蛋白复合凝胶的制备方法”，需要外加交联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，这不利于保持包埋在凝胶中的细胞或生物因子的活力。因此，开发一种工艺简单、凝胶化时间可控且能保持干细胞活力的丝素蛋白水凝胶并将其用于骨缺损修复领域是未来研发的重点。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于针对现有技术的不足，提供一种纳米杂化丝素蛋白水凝胶的制备方法。本专利技术通过将纳米级羟基磷灰石和再生丝素蛋白水溶液混合后，于一定条件下进行超声处理制备得到杂化丝素蛋白水溶液。具体地，通过改变纳米级羟基磷灰石与再生丝素蛋白的混合比例及其混合液的超声条件，使凝胶化时间控制在几十秒到几十分钟不等。另外，所得的杂化丝素蛋白水凝胶可用于牙周干细胞包埋，并能很好的保持牙周干细胞的活力，特别适用于骨缺损的再生修复。本专利技术的另一目的是提供通过上述制备方法得到的纳米杂化丝素蛋白水凝胶。本专利技术的再一目的是提供上述纳米杂化丝素蛋白水凝胶的应用。本专利技术的上述目的通过以下方案予以实现：一种纳米杂化丝素蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：(1)将蚕茧和NaCO3水溶液进行煮沸脱胶、洗涤烘干后即得丝素蛋白纤维；将丝素蛋白纤维和LiBr溶液混合，溶解，得到溶液A；将溶液A透析、过滤，得到再生丝素蛋白水溶液；(2)将纳米级羟基磷灰石(nHA)溶液和步骤(1)中的再生丝素蛋白水溶液混匀后，超声，得到凝胶化时间可控的nHA杂化丝素蛋白水溶液；(3)将步骤(2)制备得到的杂化丝素蛋白水溶液与干细胞混匀，原位凝胶化后进行细胞培养，即得纳米杂化丝素蛋白水凝胶。步骤(1)中所述的NaCO3水溶液的浓度为0.02M。步骤(1)中所述的NaCO3水溶液的用量优选按NaCO3水溶液：蚕茧＝质量比45～55:1配比计算；更优选按NaCO3水溶液：蚕茧＝质量比50:1配比计算。步骤(1)中所述的煮沸时间为15～45min；优选为30min。步骤(1)中所述的煮沸脱胶的处理次数优选为两次。步骤(1)中所述的溶解的条件优选为45～70℃溶解1～4h。步骤(1)中所述的LiBr溶液的浓度优选为9～9.5M；更优选为9.3M。步骤(1)中所述的溶液A中的丝素蛋白的质量分数为15％～20％。步骤(1)中所述的透析的条件优选为于4～10℃条件下进行透析。步骤(1)中所述的透析优选为通过纯水进行透析。步骤(1)还包括稀释或浓缩步骤，在过滤步骤后进行。所述的浓缩为通过浓缩剂进行浓缩。所述的浓缩剂优选为聚乙二醇溶液；更优选为质量分数为10％～30％的聚乙二醇水溶液；最优选为聚乙二醇分子量为20000、质量分数为10％～30％的聚乙二醇水溶液。所述的浓缩的时间优选为6～24h。步骤(1)中所述的再生丝素蛋白水溶液中再生丝素蛋白的浓度为质量百分比3％～15％；更优选为质量百分比5％～8％。步骤(1)中所述的再生丝素蛋白水溶液需在低温下保存；优选在4～10℃条件下保存。步骤(2)中所述的纳米级羟基磷灰石(nHA)的粒径小于200nm；更优选为小于100nm。步骤(2)中所述的纳米级羟基磷灰石溶液中纳米级羟基磷灰石的浓度为15～30mg/mL。步骤(2)中所述的纳米级羟基磷灰石溶液优选为纳米级羟基磷灰石水溶液。为增加干细胞在纳米杂化丝素蛋白水凝胶中的存活率并有效刺激干细胞往成骨方向分化，同时保证纳米级羟基磷灰石在再生丝素蛋白基质中的分散性。步骤(2)中所述的纳米级羟基磷灰石的用量优选为按相当于所述的再生丝素蛋白质量的2％～30％计算；更优选为按相当于所述的再生丝素蛋白质量的5％～15％计算。步骤(2)中所述的超声的条件优选为50～200W超声5～120s；更优选为于100～200W超声30～60s；最优选为150～200W超声30～50s。纳米级羟基磷灰石溶液和再生丝素蛋白水溶液在上述超声条件下，可实现：(1)通过控制超声频率和时间控制往体系输入的能量，避免凝胶温度过高；(2)避免超声诱导引起的β折叠自组装速度过快或过慢，达到控制凝胶化时间在使用需求之内的目的。步骤(2)中所述的超声处理通过探针式超声震荡仪进行。为使干细胞能在凝胶基质中更好地存活，同时发挥最大的修复效率。步骤(3)中所述的干细胞的密度为3×103～6×105个/mL；优选为5×105个/mL。步骤(3)中所述的干细胞优选为牙周干细胞。步骤(3)中所述的凝胶化时间优选为10～600s；优选为300s。一种纳米杂化丝素蛋白水凝胶，由上述制备方法制备得到。所述的纳米杂化丝素蛋白水凝胶在制备生物医学工程材料中的应用，特别适合于制备用于骨组织工程修复的生物医学工程材料；尤其是制备用于骨缺损的再生修复的生物医学工程材料。与现有技术相比，本专利技术具有如下的优点及有益效果：(1)本专利技术所述的纳米杂化丝素蛋白水凝胶由再生丝素蛋白水溶液与纳米级羟基磷灰石通过预共混，经超声处理制备得到。不同于以往的羟基磷灰石杂化的丝素蛋白支架或传统丝素蛋白水凝胶，本专利技术公开的纳米杂化丝素蛋白水凝胶的制备方法，通过改变超声条件和两种材料的混合比例，控制凝胶化时间，实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纳米杂化丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)将蚕茧和NaCO

【技术特征摘要】
1.一种纳米杂化丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将蚕茧和NaCO3水溶液进行煮沸脱胶、洗涤烘干后即得丝素蛋白纤维；将丝素蛋白纤维和LiBr溶液混合，溶解，得到溶液A；将溶液A透析、过滤，得到再生丝素蛋白水溶液；
(2)将纳米级羟基磷灰石溶液和步骤(1)中的再生丝素蛋白水溶液混匀后，超声，得到凝胶化时间可控的nHA杂化丝素蛋白水溶液；
(3)将步骤(2)制备得到的杂化丝素蛋白水溶液与干细胞混匀，原位凝胶化后进行细胞培养，即得纳米杂化丝素蛋白水凝胶。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)还包括稀释或浓缩步骤，在过滤步骤后进行。


3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，
步骤(1)中所述的再生丝素蛋白水溶液中再生丝素蛋白的浓度为质量百分比3％～15％；
步骤(2)中所述的纳米级羟基磷灰石的用量按相当于所述的再生丝素蛋白质量的2％～30％计算；
步骤(3)中所述的干细胞的密度为3×103～6×105个/mL。


4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，
步骤(1)中所述的透析的条件为于4～10℃条件下进行透析；
步骤(2)中所述的超声的条件为50～200W超声5～120s。

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【专利技术属性】
技术研发人员：张黎明，邓立志，杨凡巧，王彦，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44