小鼠血栓性脑卒中模型的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种小鼠血栓性脑卒中模型的制备方法，该方法包括：将小鼠麻醉后，将颈总动脉使用缝合线打活结，分离并永久结扎颈外动脉与翼腭动脉，分离颈内动脉起始部；将颈总动脉放入血栓生成仪血管电击夹的沟槽内进行电刺激形成血栓；取下电击夹，夹闭颈总动脉的远心端，使用显微镊粉碎血栓，动脉恢复搏动并冲击碎栓；放开动脉夹，用镊子驱赶血栓进入颈内动脉后立即夹闭颈总动脉近心端，到时间后打开全部动脉夹，形成目的栓塞模型。本发明专利技术的小鼠血栓性脑卒中模型可应用于脑卒中治疗药物、治疗方法以及发病机理的研究。

The preparation method of mouse thrombotic stroke model

【技术实现步骤摘要】
小鼠血栓性脑卒中模型的制备方法
本专利技术是关于一种动物脑卒中模型的制备方法，具体而言，是关于一种新型小鼠血栓性脑卒中模型的制备方法，以及所制备的小鼠血栓性脑卒中模型在脑血栓的溶栓研究中的应用。
技术介绍
脑卒中又称中风或脑血管意外，是严重威胁人类健康的常见病和多发病。最新数据显示，我国每年新发脑卒中约270万人，且以每年近9％的速度上升，是我国成年居民第一致死和致残病因。脑卒中分为缺血和出血性，其中缺血性脑卒中是临床上最常见的脑卒中类型(发病率占8成左右)，它主要是由血液中的各种栓子(如心脏内的附壁血栓、动脉粥样硬化的斑块等)随血流进入脑动脉而阻塞血管，引起该动脉供血区脑组织缺血性坏死，进而出现局灶性的神经功能缺损(HankeyGJ.Stroke.Lancet.2017；389(10069):641-654)。目前缺血性脑卒中的治疗方法主要是药物溶栓。重组组织型纤溶酶原激活物(recombinanttissue-typeplasminogenactivator,rtPA)是目前唯一被FDA批准用于缺血性脑卒中的溶栓药物，但其有效治疗窗狭窄，仅有3.5-4.5h，超过这一时间使用溶栓药物极易引发脑出血从而危及生命。由于上述情况，导致我国仅有1.6％左右的患者入院后具备接受溶栓治疗的条件。因此，使用动物模型模拟脑卒中发病特征，进行治疗药物研发具有重要意义。为了阐明脑卒中的发病机制，研发脑卒中治疗药物，人们在近四十年里专利技术了一系列脑卒中动物模型。使用动物模型在脑卒中的治疗方法和药物研发中有着无法替代的重要地位，其原因在于：(1)人类脑卒中的病因和病理特征多样而且复杂，使用实验用动物模型可以控制发病的变量，使发病机制的研究变得有迹可循。(2)许多分子、基因、生化或病理检查都需要一定量的脑组织，这在临床操作中极难实现。(3)脑卒中发病极早期的病理变化往往无法通过临床影像技术观察，因而只能通过动物模型进行研究。(4)使用体外细胞模型难以模拟动物模型中的血管结构及再灌注的病理进程。尽管学者们已经在脑卒中的临床前研究中取得了许多重要的进展，但大量的临床前研究却并未产生出相应的脑卒中治疗药物，目前除去rtPA，极少有神经保护药物的治疗作用能够在国际范围内得到广泛应用。为解决上述问题，脑卒中治疗学术与企业圆桌会议(StrokeTherapyAcademicIndustryRoundtable，STAIR)规定了临床前脑卒中研究的严格标准，以及对新型脑卒中模型的迫切需求。作为一个好的脑卒中模型，应尽可能模拟临床上血栓的形成与栓塞过程，带有脑卒中发病的并发症状(FisherM,FeuersteinG,HowellsDW,HurnPD,KentTA,SavitzSI,LoEH,GroupS.Updateofthestroketherapyacademicindustryroundtablepreclinicalrecommendations.Stroke.2009；40(6):2244-2250)。目前的啮齿类动物局灶性脑卒中动物模型可以分为五类：线栓法、开颅法、光照造栓法、局部凝血法和血栓栓塞法。线栓法是目前最常用的脑缺血模型。该模型通常使用适宜直径的尼龙线由颈外动脉经颈总动脉插入脑中动脉阻塞血流，形成栓塞模型。该方法对动物的侵入性较小，插入的栓线可以完全阻断中动脉供血，造成稳定的脑梗死体积，形成稳定的神经与运动功能障碍。然而该方法与临床脑卒中的形成与发展过程不一致，也不适用于溶栓药物的研发。开颅法是通过开颅手术直接暴露脑白质表面的中动脉，再通过电凝形成永久性缺血，或使用动脉夹等器械在一定时间内阻断血流。此类方法的优点在于能够形成稳定的梗死体积，动物死亡率较低，并由于可直接观察到是否堵塞中动脉，因而造模成功率较高。但是由于开颅手术的原因，容易对中动脉附近的脑白质造成物理性损伤。此外，手术过程会对颅内压和血脑屏障功能造成影响，从而增加行为学评分的差异性。光照造栓法是基于内注射光敏染料(Rosebengal,erythrosinB)，然后无需开颅，使用特定波长的激光照射MCA，通过在MCA血管内发生过氧化损伤内皮细胞，激活血小板形成血栓。此方法侵入性较小，可形成稳定的梗死体积，死亡率较低。但是该方法会在脑血管内产生大量氧自由基，从而快速形成缺血性损伤及血管源水肿(胞外水肿)，半暗带较少。因此，该方法的脑卒中发病进程与临床情况有所区别，对药效评价造成一定的影响。局部凝血法采用类似于线栓法的手术操作，将含有致凝剂(内皮素-1或凝血酶)的微导管插入中动脉，注入特定量的致凝剂引发凝血。该方法模拟原发性脑栓塞，同样是一类低侵入性，低死亡率的造模方式。通过这种方法形成的血栓可以进行溶栓研究，但是注射致凝剂后会出现血流迅速下降并在数小时内逐渐回升至稳定的现象(可能与致凝剂的体内代谢有关)，因此其缺血时间难以确定。此外，由于内皮素受体在神经元与星形胶质细胞中也有表达，因此注射后会造成神经突起的生长和胶质发生，从而对实验结果产生影响。血栓栓塞法通过在体外制造新鲜或干燥血块，再通过导管注入中动脉导致脑血管堵塞。目前动物实验使用的栓子主要有两种，一是塑料栓子，大小均匀，可以形成比较稳定的脑缺血模型；二是使用大鼠自身血液在体外形成的血栓。该方法模拟非原发性卒中，堵塞在脑部的血栓可以进行溶栓药物的药效评价。病理进程接近临床实际情况，然而由于血栓在体外形成，无法模拟血栓在体内的形成与老化过程。血栓导入血管内不易黏附在血管壁上，易造成梗死体积与梗死区域的变化甚至发生血栓自溶现象，因此不适用于进行药物溶栓时间窗的研究。上述模型特点总结于表1。表1.常见啮齿类动物脑卒中模型优缺点比较现有的脑卒中造模方法的优缺点如前文所述。总结起来主要存在两个问题：不符合实际的临床病理进程以及无法进行溶栓时间窗研究。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于克服现有技术脑卒中造模方法不符合实际的临床病理进程等缺点，提供一种能够模拟非原发性脑卒中的血栓形成与栓塞过程病理进程的小鼠脑卒中模型，并且该模型适用于脑卒中的溶栓药物时间窗研究。为实现上述目的，一方面，本专利技术提供了一种小鼠血栓性脑卒中模型的制备方法，该方法包括：将小鼠麻醉后，将颈总动脉使用缝合线在远心端打活结，分离并永久结扎颈外动脉近心端，分离颈内动脉起始部；将颈总动脉放入血栓生成仪血管电击夹的沟槽内进行两次电刺激，电流强度0.3～0.4mA，第一次持续电刺激50～80sec形成100％堵塞后松开电击夹，形成长度为2～3mm的黑色血栓。第一次电刺激结束后动脉失去搏动，取下电击夹，使用显微镊粉碎血栓，动脉恢复搏动并冲击碎栓，此时打开颈总动脉活结，使血栓进入颈内动脉；再次将颈总动脉远心端打活结，放入电击夹，使用同样电流强度第二次电刺激，第二次持续电刺激150～180sec，取下电击夹，形成长度为3～5mm的黑色血栓，第二次电刺激结束后使用上述同样方法用显微镊粉碎血栓，动脉恢复搏动并冲击碎栓，打开颈总动脉活结，使血栓进入颈内动脉。血栓本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小鼠血栓性脑卒中模型的制备方法，该方法包括：/n将小鼠麻醉后，将颈总动脉远心端使用缝合线打活结，分离并永久结扎颈外动脉近心端，分离颈内动脉起始部；/n将颈总动脉放入血栓生成仪血管电击夹的沟槽内进行两次电刺激，电流强度0.3～0.4mA，第一次持续电刺激50～80sec形成100％堵塞后松开电击夹，形成一段长2～3mm的黑色血栓，使用显微镊粉碎血栓，动脉恢复搏动并冲击碎栓，打开颈总动脉活结，使血栓进入颈内动脉；/n再次将颈总动脉远心端打活结，放入电击夹，使用同样电流强度电击150～180sec，取下电击夹，形成长度为3～5mm的黑色血栓，使用显微镊粉碎血栓，动脉恢复搏动并冲击碎栓，打开颈总动脉活结，血栓进入颈内动脉后立即夹闭颈总动脉近心端5～10min，到时间后打开动脉夹，缝合颈部皮肤，形成目的栓塞模型。/n

【技术特征摘要】
1.一种小鼠血栓性脑卒中模型的制备方法，该方法包括：
将小鼠麻醉后，将颈总动脉远心端使用缝合线打活结，分离并永久结扎颈外动脉近心端，分离颈内动脉起始部；
将颈总动脉放入血栓生成仪血管电击夹的沟槽内进行两次电刺激，电流强度0.3～0.4mA，第一次持续电刺激50～80sec形成100％堵塞后松开电击夹，形成一段长2～3mm的黑色血栓，使用显微镊粉碎血栓，动脉恢复搏动并冲击碎栓，打开颈总动脉活结，使血栓进入颈内动脉；
再次将颈总动脉远心端打活结，放入电击夹，使用同样电流强度电击150～180sec，取下电击夹，形成长度为3～5mm的黑色血栓，使用显微镊粉碎血栓，动脉恢复搏动并冲击碎栓，打开颈总动脉活结，血栓进入颈内动脉后立即夹闭颈总动脉近心端5～10min，到时间后打开动脉夹，缝合颈部皮肤，形成目的栓塞模型。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述小鼠为C57BL/6小鼠。


3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述小鼠为6-8周龄体重20-30g的雄性小鼠。


4.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：畅君雷，马寅仲，何岍妍，尹美芳，刘翠莲，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44