一种采用酶法生产高纯度(R)-(-)-3-羟基丁酸的方法技术

本发明专利技术公开一种采用酶法生产高纯度(R)‑(‑)‑3‑羟基丁酸的方法。本发明专利技术方法相比于化学法和全细胞发酵法而言，具有反应条件温和、废液产生少、(R)‑(‑)‑3‑羟基丁酸的化学纯度高和旋光性单一等优点。由于酶法生产(R)‑(‑)‑3‑羟基丁酸的培养基成分远比全细胞发酵法的培养基成分简单，因此对产品分离的成本也会大幅度降低，纯度也将更高。本发明专利技术采用Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans菌在特定培养环境下产生PHB解聚酶，同时以PHB作为碳源和诱导物进行酶解，酶的催化效率极高。

A method of producing high purity (R) - (-) - 3-hydroxybutyric acid by enzymatic method

【技术实现步骤摘要】
一种采用酶法生产高纯度(R)-(-)-3-羟基丁酸的方法
本专利技术属于生物工程领域，涉及一种采用酶法生产高纯度(R)-(-)-3-羟基丁酸的方法，具体涉及一种通过微生物发酵生产聚-3-羟基丁酸酯解聚酶，并利用该解聚酶降解聚-3-羟基丁酸酯生产高纯度(R)-(-)-3-羟基丁酸单体的方法。
技术介绍
(R)-(-)-3-羟基丁酸((R)-(-)-3-Hydroxybutanoicacid)是3-羟基丁酸外消旋体中的R-构型的异构体，是一种具有光学活性的手性化合物，CAS号为625-72-9。在人体中，(R)-(-)-3-羟基丁酸通常是在肝脏中合成，原料是乙酰辅酶A，此反应是由(R)-(-)-3-羟基丁酸脱氢酶催化产生。(R)-(-)-3-羟基丁酸可用作大脑在低血糖时的备用能源，此化合物在人体饥饿状态时的低血糖生理反应中，扮演重要角色。此外，(R)-(-)-3-羟基丁酸对某些疾病具有一定的治疗功能，例如：(1)能够治疗与酮体水平相关的症状，如对神经紊乱疾病或神经退化性的疾病有缓解的作用。(2)能够治疗与糖代谢的相关疾病，如Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病低酮体症。(3)(R)-(-)-3-羟基丁酸是内源性组蛋白去乙酰化酶的阻断剂，在较低浓度时可保护细胞免遭“氧化应激”损害。基于(R)-(-)-3-羟基丁酸的营养价值及药用价值，其本身及其衍生物有极大的生产保健产品及药品的潜力。目前3-羟基丁酸的生产方法主要是化学法，由3-羟基丁醛催化氧化得到(S/R)-3-羟基丁酸，该反应需在酸性条件下进行，而此条件下3-羟基丁酸容易发生分子内脱水而形成丁烯醛/酸，影响反应最终的转化率与收率；或使用3-羟基丁酸内酯的水解反应得到纯度较高的3-羟基丁酸，但需要添加剧毒的氰化物，导致废液污染环境。在(R)-3-羟基丁酸及其盐的生产方法(专利号(CN107162893A)中，采用了醇解PHB得到三羟基丁酸乙酯后，再与强碱反应得到3-羟基丁酸盐的方法，醇解反应时需消耗大量醇类物质，并需要添加硫酸维持酸性条件，并不能一步直接获得3-羟基丁酸或盐，相对于生物法的一步法得到产物过程复杂且有副产物产生。在化学法合成过程中需要高温高压并添加手性金属催化剂，过程冗长且伴随副产物，产生的废液处理亦需要较高的成本。生物法合成3-羟基丁酸的方法主要是由微生物自身代谢循环，将碳源转化为乙酰辅酶A，进而转化为乙酰乙酰辅酶A，3-羟基丁酰辅酶A和(R)-3-羟基丁酸。如专利(CN2017103961413、CN2016800351607)两种使用不同菌株生产3-羟基丁酸的方法，能够直接从发酵液中提取到3-羟基丁酸钠，后经直接脱色酸化获得(R)-3-羟基丁酸。申请号200910106659.4的专利技术披露了一种采用基因工程菌发酵制备(R)-3-羟基丁酸乙酯的方法，其中涉及了采用该工程菌以淀粉为底物碳源直接合成()-3-羟基丁酸的方法，但其实施例中没有分离提纯(R)-3-羟基丁酸的方法及相关产物得率的论述。相对于化学法，生物法能耗低，流程简单，反应时间更短，但从上述专利实施例中可以看到其底物转化率非常低(葡萄糖底物浓度650克/L，产物3-羟基丁酸浓度11.5克/L，糖酸转化率只有1.77％)，在生物发酵过程中需要使用多种微生物埃希氏菌属(Escherichia)、假单包菌属(Pseudomonas)、气单包菌属(Aeromonas)，过程较为复杂，且大肠杆菌作为生物工程菌有抗菌性且包含内毒素，对生产人员和环境有潜在的危害。因此，其产业化可行性较低或生产成本将非常高。此外，通过基因工程手段使生产菌株过量表达代谢通路中相关的酶，但基因工程菌目前仍有一些无法避免的问题，如质粒丢失导致的活性下降，基因操作过程中留下的多种抗生素抗性对环境来说也仍然具有威胁。同时，全细胞发酵法生产的产物不可避免地会伴生一定的副产物，这对终端产品(R)-3-羟基丁酸的质量会有一定的影响。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术无法实现高效生产高纯度(R)-(-)-3-羟基丁酸单体，且工艺简单的技术问题，提供一种采用酶法生产高纯度(R)-(-)-3-羟基丁酸的方法。本专利技术一种采用酶法生产高纯度(R)-(-)-3-羟基丁酸单体的方法，包括下述步骤：步骤(1)、扩增培养：将Diaphorobacter菌属的Diaphorobacterpolyhydroxybutyrativorans菌在LB培养基进行扩增培养，获得大量菌种。Diaphorobacter菌属的Diaphorobacterpolyhydroxybutyrativorans菌为现有成熟菌种，可通过购买获取得到。培养条件：温度控制在37℃，pH控制在7.2，180rpm，培养时间16h。步骤(2)、发酵产酶：将步骤(1)扩增培养得到的菌种置于发酵培养基中发酵培养，得到含PHB解聚酶的发酵液；发酵液离心、过滤，获得分离纯化后的PHB解聚酶粗酶液。所选发酵培养基的组成包括如下：PHB0.1～10g/L、KNO32g/L、KH2PO41g/L、Na2HPO43g/L、(NH4)2SO41g/L、MgCl2·6H2O0.01～1g/L、NaCl0.2g/L、酵母粉0.15g/L、CaCl20.02～1g/L、柠檬酸铁铵0.01g/L，消泡剂0-0.1g/L。所述的消泡剂选用聚醚类化合物。培养条件：溶氧常数控制在15～30％，更优选控制在20～25％；温度控制在30～40℃，更优选控制在35℃；pH控制在6.5～8.0，更优选控制pH在7.2。发酵产酶过程中采取流加补料的方式，整个发酵产酶过程PHB浓度控制在0.5g/L。上述通过离心的方法得到除去菌体的上清液，必要时浓缩滤液，得到PHB解聚酶粗酶液。PHB解聚酶粗酶液通过微滤膜过滤方法除去残余菌体和大分子物质，得到无菌滤液；必要时浓缩滤液，得到PHB解聚酶粗酶液。步骤(3)、酶解：以PHB作为底物，采用步骤(2)PHB解聚酶粗酶液降解PHB，通过碱控制pH值在6.5～8.0，最终得到含(R)-(-)-3-羟基丁酸盐的酶解液。解聚酶缓冲溶液成分：KNO32g/L、KH2PO41g/L、Na2HPO43g/L、(NH4)2SO41g/L、MgCl2·6H2O0.01～1g/L、NaCl0.2g/L、酵母粉0.15g/L、CaCl20.02～1g/L、柠檬酸铁铵0.01g/L。酶解条件：温度控制在30～45℃，更优选控制在37℃；pH控制在6.5～8.5，更优选控制pH在7.5。酶解过程中底物PHB采用流加补料方式，底物PHB浓度控制在0.1-10g/L，优选控制在1g/L。步骤(4)、单体纯化：从步骤(3)酶解液中采用无水乙醇提取高浓度的(R)-(-)-3-羟基丁酸盐，经酸化、蒸馏得到高纯度的(R)-(-)-3-羟基丁酸单体。在发酵生产PHB解聚酶过程中，PHB既作为碳源又作为诱导物。本专利技术的有益效果是：本专利技术方法相比于化学法和全本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种采用酶法生产高纯度(R)-(-)-3-羟基丁酸的方法，其特征在于包括下述步骤：/n步骤(1)、扩增培养：/n将Diaphorobacter菌属的Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans菌在LB培养基进行扩增培养，获得大量菌种；/n步骤(2)、发酵产酶：/n将步骤(1)扩增培养得到的菌种置于发酵培养基中发酵培养，得到含PHB解聚酶的发酵液；发酵液离心、过滤，获得分离纯化后的PHB解聚酶粗酶液；/n所选发酵培养基的组成包括如下：PHB 0.1～10g/L、KNO

【技术特征摘要】
1.一种采用酶法生产高纯度(R)-(-)-3-羟基丁酸的方法，其特征在于包括下述步骤：
步骤(1)、扩增培养：
将Diaphorobacter菌属的Diaphorobacterpolyhydroxybutyrativorans菌在LB培养基进行扩增培养，获得大量菌种；
步骤(2)、发酵产酶：
将步骤(1)扩增培养得到的菌种置于发酵培养基中发酵培养，得到含PHB解聚酶的发酵液；发酵液离心、过滤，获得分离纯化后的PHB解聚酶粗酶液；
所选发酵培养基的组成包括如下：PHB0.1～10g/L、KNO32g/L、KH2PO41g/L、Na2HPO43g/L、(NH4)2SO41g/L、MgCl2·6H2O0.01～1g/L、NaCl0.2g/L、酵母粉0.15g/L、CaCl20.02～1g/L、柠檬酸铁铵0.01g/L；
培养条件：溶氧常数控制在15～30％；温度控制在30～40℃；pH控制在6.5～8.0；
发酵产酶过程PHB浓度控制在0.5g/L；
步骤(3)、酶解：
以PHB作为底物，采用步骤(2)PHB解聚酶粗酶液降解PHB，通过碱控制pH值在6.5～8.0，最终得到含(R)-(-)-3-羟基丁酸盐的酶解液；
步骤(4)、单体纯化：
从步骤(3)酶解液中采用无水乙醇提取高浓度的(R)-(-)-3-羟基丁酸盐，经酸化、蒸馏得到高纯度的(R)-(-)-3-羟基丁酸单体。


2.如权利要求1所述的一种采用酶法生产高纯度(R)-(-)-3-羟基丁酸的方法，其特征在于步骤(1)培养条件：温度控制在37℃，pH控制在7.2，180rpm，培养时间16h。


3.如权利要求1-2任一所述的一种采用酶法生产高纯度(R)-(-)-3-羟基丁酸的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘倩倩，高俊飞，王刚，朱世扬，文鹏，徐佳雄，李瑞瑞，何其昌，赵欣园，陈学军，
申请(专利权)人：浙江英玛特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33