一种酶催化法合成反式-4-香豆酸的方法技术

本发明专利技术提供了一种酶催化法合成反式‑4‑香豆酸的方法。反式‑肉桂酸‑4‑单加氧酶(EC 1.14.14.91)可催化反式‑肉桂酸合成反式‑4‑香豆酸，同时消耗一分子O

Synthesis of trans-4-coumaric acid by enzymatic method

【技术实现步骤摘要】
一种酶催化法合成反式-4-香豆酸的方法
本专利技术涉及生物技术和酶催化领域；更具体地，本专利技术涉及一种酶催化法合成反式-4-香豆酸的方法。
技术介绍
对香豆酸即香豆酸(coumarate)、又名p香豆酸(p-coumalicacid)、4-香豆酸、对-羟基肉桂酸等，是羟基肉桂酸类化合物中最主要的一种；系统命名为3-(4-羟基苯基)-2丙烯酸。对香豆酸有顺式和反式两种,反式对香豆酸即反式-4-香豆酸，为白色细针状晶体,熔点212℃-214℃,略溶于冷水,溶于热水、甲醇、乙醇,微溶于苯和氯仿,不溶于二氯甲烷和石油醚。反式-4-香豆酸可形成共振稳定的酚自由基，因此具有良好的抗氧化活性；它对过氧化氢、超氧自由基、氢自由基、过氧化亚硝基有强烈的清除作用，对单线态氧有淬灭作用；在淬灭自由基的同时，对香豆酸还能抑制产生自由基的酶，促进产生清除自由基的酶。研究表明反式-4-香豆酸对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌有不同程度的抑制作用；Bodini等人的研究发现，反式-4-香豆酸能够抑制紫色色杆菌、农杆菌和绿针假单胞菌的群体感应作。反式-4-香豆酸还对博来霉素、过氧化氢和IQ型喳琳致突变物所诱导的沙门氏菌突变有良好的抑制作用；反式-4-香豆酸还能抑制混合功能氧化酶活性，以及环磷酞胺(CP)引起的体细胞和性细胞突变。反式-4-香豆酸可应用于医药、农业、食品、化妆品等行业。作为药品，反式-4-香豆酸对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌有不同程度的抑制作用；反式-4-香豆酸不仅具有降脂作用，还有阻止胃癌发生，减少粥状动脉硬化发生的作用。在农业行业用于植物生长促进剂。在食品行业用于长效杀菌剂和果蔬保鲜防腐剂。在化妆品行业由于反式-4-香豆酸对酪氨酸单酚酶和二酚酶均有抑制作用，所以添加到化妆品里抑制黑色素的生成。此外，反式-4-香豆酸还是许多具有较高应用价值的化合物的前体或中间体。例如，对香豆酸可以通过氧化，环合反应合成香豆素；反式-4-香豆酸通过降解反应生成对羟基苯甲酸；反式-4-香豆酸还可作为祛痰药杜鹃素、抗肾上腺素药物艾司洛尔等物质合成的中间体，还可以用于临床上治疗轻、中度老年痴呆的药物-加烂他敏的合成。反式-4-香豆酸的广泛应用，造成了其具有强大的市场需求，但是现有的反式-4-香豆酸工业化生产方法却不能满足这一需求。现有的生产主法主要有以下几种：提取法：从甘蔗渣、玉米皮、麸皮、竹茹等中提取，虽然该方法提取出来的反式-4-香豆酸是纯天然的，但产率低，成本高。化学合成：由对羟基苯甲醛和丙二酸经缩合反应制得，该方法的主要缺陷在于产品非天然，此外，生产过程化学污染大，成本高。生物转化法生产反式-4-香豆酸的方法有两条途径：一种是酪氨酸/(苯丙氨酸)解氨酶途径，该途径属于EC4.3.1.23和EC4.3.1.25下的酶；专利有：一种来源于虎眼万年青的苯丙氨酸解氨酶，其核苷酸序列及应用，专利号为：201310466953.2，目前处于无权-视为撤回状态。一种酵母菌的用途及天然对香豆酸的生产方法，专利号为：201510411910。该途径既有酶(全细胞)催化法也有发酵发生产反式-4-香豆酸，其中201510411910专利为发酵法，产量可达10g/L左右。另外一种是反式-肉桂酸-4-羟化酶途径，该途径属于EC1.14.14.91下的酶；专利有：一种反式肉桂酸-4-羟基化酶及其编码基因与应用，专利号为：201710136604，目前处于审中-实审阶段。该专利所述的方法为发酵法，其辅酶的循环、底物均由宿主菌提供；该方法产率不高，且纯化成本较高。
技术实现思路
本专利技术提供了一种酶催化法合成反式-4-香豆酸的方法；反式-肉桂酸-4-单加氧酶(EC1.14.14.91)可催化反式-肉桂酸合成反式-4-香豆酸，同时消耗一分子O2和一个NAD(P)H,生成一个H+和一个NAD(P)+。在单水相或水/有机溶剂的双相反应体系中，加入反式-肉桂酸(原料)，加入微量NAD(P)+或NAD(P)H，加入O2源，加入还原型氢供体，然后加入反式-肉桂酸4-单加氧酶和NAD(P)+还原酶，滴加碱液控制pH，控制反应温度；反应结束后反应液过滤除酶后浓缩，降温结晶可得反式-4-香豆酸反应式如下：本专利技术提供了以下技术方案：一种酶催化法合成反式-4-香豆酸的方法，在单水相或水/有机溶剂的双相反应体系中，加入反式-肉桂酸，加入微量NAD(P)+或NAD(P)H，加入O2源，加入还原型氢供体，然后加入反式-肉桂酸-4-单加氧酶和NAD(P)+还原酶，滴加碱液控制pH，控制反应温度；反应结束后反应液过滤除酶后浓缩，降温结晶可得反式-4-香豆酸；其中，反式-肉桂酸-4-单加氧酶的编号为：EC1.14.14.91。当反式-肉桂酸-4-单加氧酶需要的辅酶为NADH时，反应体系中添加微量的NAD+或NADH；当反式-肉桂酸-4-单加氧酶需要的辅酶为NADPH时，反应体系中添加微量的NADP+或NADPH。所述O2源为空气、氧气或H2O2，向反应体系中通空气或氧气或加入的方式来补充消耗掉的氧；反应体系中氧的浓度可以通过溶氧电极进行监控；可以通过加压的方式提高反应溶液中的氧溶解度。所述的碱为氨水、NaOH或KOH；pH控制范围为5.0～10.0，优选的，pH控制范围为6.0～8.0，优选的，pH控制范围为6.8～7.5。所述的还原型氢供体为葡萄糖、异丙醇、甲酸或甲酸盐。当还原型氢供体为葡萄糖时，反应中加入的NAD(P)+还原酶为葡萄糖脱氢酶，此酶能够通过葡萄糖供氢产生NAD(P)H；当还原型氢供体为异丙醇时，反应中加入的NAD(P)+还原酶为异丙醇脱氢酶，此酶能够通过异丙醇供氢产生NAD(P)H；当还原型氢供体为甲酸或甲酸盐时，反应中加入的NAD(P)+还原酶为甲酸脱氢酶，此酶能够通过甲酸供氢产生NAD(P)H；当反式-肉桂酸-4-单加氧酶所需的辅酶为NADH时，所述的NAD(P)+还原酶为NAD+还原酶，当反式-肉桂酸-4-单加氧酶所需的辅酶为NADPH时，所述的NAD(P)+还原酶为NADP+还原酶。所述反式-肉桂酸-4-单加氧酶包括但不限于具有以下氨基酸序列的反式-肉桂酸-4-单加氧酶，所述的氨基酸序列可以是SEQ01、SEQ02、SEQ03、SEQ04、SEQ05、SEQ06、SEQ07、SEQ08、SEQ09、SEQ10、SEQ11、SEQ12、SEQ13、SEQ14、SEQ15或SEQ16；或所述反式-肉桂酸-4-单加氧酶是具有所述氨基酸序列的单点和/或多点突变体的反式-肉桂酸-4-单加氧酶；或所述反式-肉桂酸-4-单加氧酶是与所述氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列的反式-肉桂酸-4-单加氧酶。用于表达所述反式-肉桂酸-4-单加氧酶的宿主为大肠杆菌、芽孢杆菌、霉菌或酵母的一种；优选的，其表达体系为大肠杆菌BL21表达体系或者毕赤酵母GS115表达体系。所述反式-肉桂酸-4-单加氧酶可以是所构建的宿主菌表达后的发酵液或菌泥，也可以是经简单处理的粗酶或经纯化处理本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酶催化法合成反式-4-香豆酸的方法，其特征在于：在单水相或水/有机溶剂的双相反应体系中，加入反式-肉桂酸，加入微量NAD(P)

【技术特征摘要】
1.一种酶催化法合成反式-4-香豆酸的方法，其特征在于：在单水相或水/有机溶剂的双相反应体系中，加入反式-肉桂酸，加入微量NAD(P)+或NAD(P)H，加入O2源，加入还原型氢供体，然后加入反式-肉桂酸-4-单加氧酶和NAD(P)+还原酶，滴加碱液控制pH，控制反应温度；反应结束后反应液过滤除酶后浓缩，降温结晶可得反式-4-香豆酸；其中，反式-肉桂酸-4-单加氧酶的编号为：EC1.14.14.91。


2.如权利要求1所述酶催化法合成反式-4-香豆酸的方法，其特征在于：当反式-肉桂酸-4-单加氧酶需要的辅酶为NADH时，反应体系中添加微量的NAD+或NADH；当反式-肉桂酸-4-单加氧酶需要的辅酶为NADPH时，反应体系中添加微量的NADP+或NADPH。


3.如权利要求1所述酶催化法合成反式-4-香豆酸的方法，其特征在于：所述O2源为空气、氧气或H2O2。


4.如权利要求1所述酶催化法合成反式-4-香豆酸的方法，其特征在于：所述的碱为氨水、NaOH或KOH；pH控制范围为5.0～10.0，优选的，pH控制范围为6.0～8.0，优选的，pH控制范围为6.8～7.5。


5.如权利要求1所述酶催化法合成反式-4-香豆酸的方法，其特征在于：所述的还原型氢供体为葡萄糖、异丙醇、甲酸或甲酸盐。


6.如权利要求5所述酶催化法合成反式-4-香豆酸的方法，其特征在于：当还原型氢供体为葡萄糖时，反应中加入的NAD(P)...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈江，孙军亭，徐光彩，
申请(专利权)人：陈江，孙军亭，徐光彩，
类型：发明
国别省市：江苏;32