一种有效转染DNA的纳米载体及其制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种有效转染DNA的纳米载体及其制备方法及其应用，该纳米粒子向NH

An effective nano carrier for DNA transfection and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种有效转染DNA的纳米载体及其制备方法及其应用
本专利技术属于具有光动力活性的纳米载药领域，具体涉及一种有效转染DNA的纳米载体及其制备方法和在光敏肿瘤治疗中的应用。
技术介绍
光动力疗法(Photodynamictherapy，简称PDT)是一种新型的肿瘤治疗方法。以特定波长的光激发富集于肿瘤部位的光敏剂，光敏剂与周围的氧气反应产生活性氧，通过氧化损伤肿瘤细胞内的生物大分子，达到抑制肿瘤的效果。光敏剂、光源及氧气是PDT的三个关键要素。传统的PDT主要依靠外源性激发光源，对应光源组织穿透深度浅，大多只能用于浅表病灶治疗。因此，寻求有效方法解决光源穿透深度的问题对实现PDT体内肿瘤治疗具有重大意义。生物自发光是一种特殊的化学发光，能使化学能转变为光能的效率达到100％。其发光机制是在一定的条件下，特定的酶催化底物发生氧化释放光子，进而敏化光敏剂产生活性氧，杀死肿瘤细胞，用于治疗深层病变。近年来，许多不同的载体已经被研究用于转染，包括树突状大分子、多肽、多糖、阳离子聚合物、脂质体和无机载体。在被研究的无机纳米载体中，纳米磷酸钙(CaP)是目前应用和研究最为广泛的生物材料。CaP具有良好的生物相容性，且其结构的稳定性依赖于环境的pH值。此外，由于转染载体的选择对转染结果影响较大，现有的基因转染载体，如阳离子聚合物、脂质类等，尽管其具有适用性较广，转染效率高，重复性好等优点，但是仍存在着对细胞毒性较大的致命缺点。因此，寻求高效转染而损伤轻微的转染载体对体内的应用具有重要意义。
技术实现思路
<br>专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种利用Hypericin&D-luciferin@CaP-PEI纳米载体，该纳米载药颗粒可明显提高DNA转染到肿瘤细胞中的效率，通过生物发光共振能量转移，实现生物内源性发光，从而达到PDT的高效治疗。本专利技术还提供该Hypericin&D-luciferin@CaP-PEI纳米载体的制备方法及其在制备光敏药物中的应用。技术方案：为了实现上述目的，如本专利技术所述一种有效转染DNA的纳米载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：向NH4H2PO4和PEI混合溶液中加入Hypericin和D-luciferin，再加入CaCl2溶液进行反应；反应完成后，离心弃去上清液，获得有效转染DNA的纳米载体。其中，所述NH4H2PO4和PEI混合溶液的pH值调至7.1-7.4。作为优选，所述向NH4H2PO4和PEI混合溶液中加入Hypericin和D-luciferin，再加入CaCl2溶液进行反应为在搅拌条件下，搅拌速率为450-500r/min。进一步地，所述搅拌速率为450r/min。进一步地，所述NH4H2PO4、PEI、CaCl2、Hypericin、D-luciferin的质量比为5400～6000：1400～1460：220～280：1～1.2：36～40。最优选的NH4H2PO4、PEI、CaCl2、Hypericin、D-luciferin的质量比为6000：1460：250：1：36。其中，所述反应直至用激光笔照射溶液呈一道明显通路才停止，反应温度为室温。本专利技术所述的制备方法所制成的一种有效转染DNA的Hypericin&D-luciferin@CaP-PEI纳米载体。本专利技术所述的有效转染DNA的Hypericin&D-luciferin@CaP-PEI纳米载体在制备光敏肿瘤治疗药物中的应用。进一步地，所述应用为利用Hypericin&D-luciferin@CaP-PEI纳米载体高效转染DNA到肿瘤细胞中的能力，构建DNA&Hypericin&D-luciferin@CaP-PEI转染体系，该体系可通过生物发光共振能量转移，实现生物内源性的发光，从而达到PDT的高效治疗在制备光敏肿瘤治疗药物中的应用。本专利技术针对传统PDT中光源对生物组织穿透力弱及CaP转染DNA效率低下的问题，利用Hypericin&D-luciferin@CaP-PEI纳米载体高效转染DNA到肿瘤细胞中的能力，构建DNA&Hypericin&D-luciferin@CaP-PEI载体体系，该体系可通过生物发光共振能量转移，实现生物内源性的发光，从而达到PDT的高效治疗。机理：本专利技术制备的Hypericin&D-luciferin@CaP-PEI纳米载体，由于PEI的外层带有正电荷，可与带负电荷的DNA有效结合，明显提高纳米载体将DNA转染到肿瘤细胞中的效率。本专利技术所制成的有效转染DNA的Hypericin&D-luciferin@CaP-PEI纳米载体进入肿瘤细胞后，肿瘤细胞的酸性环境使得CaP崩解，释放DNA、Hypericin及D-luciferin。在ATP及Mg2+的存在下，DNA催化D-luciferin产生520～680nm的荧光，有效激发Hypericin产生活性氧，发挥PDT活性。具体的，本专利技术选用生物可降解材料CaP和聚乙烯亚胺(PEI)，具有有效单线态氧产率的光敏剂金丝桃素(Hypericin)及高量子效率的底物(D-luciferin)作为原材料，制备出包裹Hypericin及D-luciferin的CaP-PEI纳米载体Hypericin&D-luciferin@CaP-PEI。由于PEI的外层带有正电荷，与带负电荷的DNA有效结合。通过转染，将外源性的DNA有效转染于肿瘤细胞内，肿瘤细胞的酸性条件使CaP崩解，释放出DNA、Hypericin及D-luciferin。在细胞内ATP及Mg2+的存在下，DNA催化D-luciferin产生520～680nm的荧光，有效激发Hypericin产生活性氧，发挥PDT活性。生物发光能效较低且发光强度远低于外加光源。因此，基于此的PDT体系往往需要大量荧光素酶才能保证理想的PDT效果。与传统的直接共载荧光素酶、底物及光敏药物的生物发光PDT治疗体系相比，本专利技术全新的纳米载体体系将可表达荧光素酶的微量质粒DNA转染入肿瘤细胞，持续且高效表达大量荧光素酶，避免了荧光素酶大量使用产生的装载难度提升、稳定性保持较难等应用瓶颈。在本专利技术中，细胞内本来就有一定浓度的ATP及Mg2+，DNA转染进细胞，以及D-luciferin、Hypericin药物进入细胞后，在ATP及Mg2+的条件下，DNA催化D-luciferin产生520～680nm的荧光，与Hypericin的吸收光谱完美匹配，从而有效激发Hypericin产生活性氧，发挥PDT活性。本专利技术证明外加光源与生物自发光体内抗肿瘤活性相当，表明杀死肿瘤细胞的活性相当，可证明无需外加光源发挥活性。有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：1、本专利技术所制得的Hypericin&D-luciferin@CaP-PEI纳米载体，具有减少细胞内免疫反应和对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种有效转染DNA的纳米载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/n向NH

【技术特征摘要】
1.一种有效转染DNA的纳米载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
向NH4H2PO4和PEI混合溶液中加入Hypericin和D-luciferin，再加入CaCl2溶液进行反应；反应完成后，离心弃去上清液，获得有效转染DNA的纳米载体。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述NH4H2PO4和PEI混合溶液的pH值优选调至7.1-7.4。


3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述向NH4H2PO4和PEI混合溶液中加入Hypericin和D-luciferin，再加入CaCl2溶液进行反应为在搅拌条件下，搅拌速率为450-500r/min。


4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述NH4H2PO4、PEI、CaCl2、Hypericin、D-luciferin的质量比为5400～6000：1400～1460：220～280：1～1.2：36～40。...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏少华，胡金慧，周家宏，周林，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32