一种在制备饲料级胰酶中的灭活病毒的方法技术

本发明专利技术提供一种从胰渣中提取饲料级胰酶过程中的灭活病毒的方法，它将原料胰渣经过粉碎、溶解、板框压滤后，上清液加入有机溶剂和活性剂进行病毒灭活，再经超滤、制粒、包衣和干燥，分装得制品。通过有机溶剂和活性剂破坏病毒的脂质包膜，同时保持胰酶的结构和功能，使制品纯度和活性提高，不仅病毒灭活操作简单，处理时间短，经济实用，而且该发明专利技术具有污染小、设备简单、生产周期短、无需添加激活剂、性质稳定便于保存、安全性好等特点。

A method of inactivating virus in the preparation of feed grade pancreatin

【技术实现步骤摘要】
一种在制备饲料级胰酶中的灭活病毒的方法
本专利技术涉及胰酶制剂和在生产胰酶制剂过程中灭活病毒的方法，属于生物
，特别涉及有机溶剂和活性剂在制备饲料级胰酶过程中灭活病毒的方法。
技术介绍
乳仔乳仔猪、雏鸡、雏鸭、乳牛等幼龄动物消化道发育不全，内源性消化酶系没有建立，再加上早期断奶等饲养应激，幼龄动物非常容易出现营养性腹泻和其他原因的腹泻，实际生产中通常使用抗生素进行饲喂或治疗，从而导致抗生素残留和超量使用。通过添加合适的酶制剂，可以预防幼龄动物营养性腹泻的发生，从而减少抗生素的使用。胰酶，是一种具有特殊功能的蛋白质。医药行业胰酶主要用于消化不良，食欲不振及肝、胰腺疾病引起的消化障碍，同时也适用于先天性胰功能不全、腹部手术和外伤胰腺切除导致的胰功能不全。或未经手术切除后天引起的胰功能不全及酒精中毒引起的慢性胰腺炎等。同样，胰酶在饲料行业也有广泛的应用价值，它不仅可以给动物提供蛋白质来源，由于其中含有大量具有生物活性的成分，如蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶和活性肽。目前工业胰酶的传统制备工艺多以猪或牛胰脏为原料，经原料处理(刨片、磨浆)、激活、提取、分离(过滤、沉淀、压榨)、脱脂、制粒、干燥、粉碎等多道工序。药物用血管紧张素的提取原料来源于粗酶粉(来源于猪的胰腺)，粗酶粉中含有血管紧张素以外，还同时含有胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶。而提取血管紧张素的工艺主要是采用水洗和特定分子滤膜过滤，对其中的酶破坏较小。粗酶粉提取药物用血管紧张素后剩余的胰渣用作制备胰酶的原料具有一定的经济价值和可行性，充分综合利用了胰渣资源，在环境保护及资源节约方面具有重大意义。为了保证该制品的安全性，除要控制猪的饲养环境和原料胰渣的质量外，在胰酶的生产过程中，如何有效的除去或灭活原料中的病毒，是获得安全可靠的饲料胰酶产品的关键问题。随着动物源性组织制备的制品逐渐增多,加之动物源性产品原材料质量控制未引起足够重视,目前动物源性产品病毒感染畜禽的风险性和潜在的医源性感染问题变得日益突出。为确保制品的安全性,在生产工艺中增加有效的病毒灭活/去除措施是非常必要的。目前国内外较为成熟的去除和灭活病毒的方法主要有化学法和物理法。1、化学法化学灭活法是利用化学药品或酶使微生物、活性物质的一些结构发生改变，从而丧失生命力、感染性、毒性或活性。化学灭活效果确实、方法简便而最为常用，但化学灭活的效果常受灭活剂种类、剂量和作用温度、pH、时间等因素影响，微生物的种类和含氮量及是否存在有机物等因素有关，因此必须筛选最佳的灭活条件。1.1有机溶剂/表面活性剂(S/D)法早在20世纪80年代中期S/D法开始发展应用，目前依然是血液制品中一种核心的病毒灭活方法。此方法的基本原理是：有机溶剂和非离子表面活性剂的混合物能够破坏脂包膜病毒的类脂膜，从而使类脂从病毒表面脱落，使病毒失去黏附和感染细胞的能力。RobertsPL(2008)对S/D法用于高纯度的凝血因子进行病毒灭活的有效性进行了详尽的考察。结果显示，以0.3％的TN-BP和1％的Triton－X100为S/D试剂，在22℃条件下处理30min后可以对凝血因子制品中的牛痘病毒、单纯疱疹病毒、辛德毕斯病毒等模拟脂包膜病毒进行有效的灭活，证实了S/D法用于脂包膜病毒灭活的稳健性和有效性。S/D法主要用于凝血因子制品、蛋白酶抑制剂、人免疫球蛋白等血液制品的脂包膜病毒的灭活。1.2低pH孵放法低pH孵放在20世纪80年代初用于注射用人免疫球蛋白的制备过程中防止免疫球蛋白的聚合，随后发现其对大部分的脂包膜病毒有灭活作用，后被用于血液制品的病毒灭活。灭活机理是:在pH4，温度30～37℃条件下保温超过20h，某些病毒成分产生变质，从而影响病毒的复制，最终使病毒失去传染性。Roberts等(2012)对孵放法进行了考察，研究表明，在pH5、30℃条件下对静脉注射用免疫球蛋白持续处理14d能够对脂包膜病毒和部分非包膜病毒进行有效的灭活。证实了该方法可以作为生产过程的终端处理，和S/D法、离子交换层析法结合共同用于注射用免疫球蛋白的病毒灭活，保证免疫球蛋白产品的安全性。该方法要求蛋白质产品的活性在低pH条件下保持稳定，因此一般只用于免疫球蛋白脂包膜病毒的灭活。1.3辛酸处理法早在20世纪90年代初，Lundblad等(1991)报道了辛酸钠灭活4种脂包膜蛋白的机制，揭开了辛酸法在病毒灭活中的应用。此法是在低pH条件下，辛酸的非离子形式具有亲脂性，能够进入病毒脂包膜从而破坏脂质双分子层和相关蛋白质的完整性，使脂包膜病毒失去传染性，达到脂包膜病毒的灭活作用。Dichtelmüller等(2002)以3批注射用免疫球蛋白制剂作为研究对象，对辛酸法用于免疫球蛋白溶液病毒灭活的有效性进行了考察。结果显示7.45g/kg的辛酸溶液能够在极短的时间(1min)内对人免疫缺陷病毒、牛病毒性腹泻病毒、辛德毕斯病毒、伪狂犬病病毒进行有效的灭活。由于辛酸法需要在低pH(通常pH＜6)条件下发挥作用，要求蛋白质产品在低pH条件下能够保持其稳定性，因此目前主要用于免疫球蛋白M和免疫球蛋白G的病毒灭活。1.4光化学法亚甲蓝(MB)/可见光处理法、补骨脂素/UVA处理法、核黄素/UV处理法等是目前常用的光化学方法(谭美芳等，2012)，主要用于全血浆以及血小板制品的病毒灭活。MB/可见光法病毒灭活的原理(胡小兵等，2003)是:MB是一种带正电荷的感光吩噻嗪染剂，可以穿过病毒的包膜与核酸结合，在一定强度的光照射下发生光化学反应，产生羟基自由基和单态氧，阻止核酸的复制从而达到病毒灭活的目的。此法对脂包膜病毒有良好的灭活效果，对非包膜病毒灭活效果不理想。此外，对于不稳定的蛋白产品可能造成功能活性的损失，目前多有文献报道(程玉根等，2007)此病毒灭活方法对于血浆蛋白的影响变化。2、物理法2.1巴氏消毒法巴氏消毒法是在60℃条件下对蛋白质溶液进行连续加热至少10h，使病毒蛋白变性，从而抑制病毒遗传物质的复制，最终使病毒失去传染性。Chandra等(2002)通过相关文献的检索对巴氏消毒法进行了详细的综述，结果表明巴氏消毒法只需要控制很少的过程参数，灭毒过程容易被监测，对脂包膜病毒和非包膜病毒均有灭活作用，灭毒范围广。作为一种传统成熟的病毒灭活方法，巴氏消毒法可以用于白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白、蛋白酶抑制剂等血液制品的脂包膜和非包膜病毒的灭活。虽然巴氏消毒法目前已成为一种广泛的血液制品病毒灭活方法，但同时存在着一些局限性:①蛋白质稳定剂的加入降低了病毒灭活的能力；②细小病毒B19有耐热性，不利于该病毒的灭活；③在热条件处理下会导致蛋白质产品的变性，使产品的活性降低，因此不能用于稳定性不好的血浆蛋白的病毒灭活。2.2干热处理法干热法最早于20世纪80年代初被用于凝血因子制品中肝炎病毒的灭活，1984年，干热法被批准用于HIV的灭活。其原理是:制剂冻干后加热处理，使病毒复制所需要的分子和结构改变，从而抑制其复制过程。干热法常用的处理条件有60℃、96h，80℃、72h本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从胰渣中提取饲料级胰酶过程中的灭活病毒的方法，其特征在于包括以下步骤：/nA、原料处理：原料为粗酶粉提取血管紧张素后的冷冻胰渣，用平板粉碎机或刨片机将原料进行粉碎，用蒸馏水溶解，再用搅拌机搅拌15-60分钟溶解，或者用磨浆机磨浆溶解，得溶解液；/nB、离心：将步骤A的溶解液用离心机离心或者板框压滤机过滤除渣，得到上清滤液；/nC、沉淀、浓缩：在步骤B的上清滤液中加入有机溶剂乙醇和活性剂，搅拌均匀后沉淀，在5-20℃条件下沉淀0.5-2.5小时，超滤收集沉淀；/nD、制粒、包衣、干燥：将步骤C中的沉淀与饲料用载体混合，利用制粒装置进行制粒，然后通过包衣装置对产品进行包衣，最后通过干燥装置进行干燥，制得胰酶。/n

【技术特征摘要】
1.一种从胰渣中提取饲料级胰酶过程中的灭活病毒的方法，其特征在于包括以下步骤：
A、原料处理：原料为粗酶粉提取血管紧张素后的冷冻胰渣，用平板粉碎机或刨片机将原料进行粉碎，用蒸馏水溶解，再用搅拌机搅拌15-60分钟溶解，或者用磨浆机磨浆溶解，得溶解液；
B、离心：将步骤A的溶解液用离心机离心或者板框压滤机过滤除渣，得到上清滤液；
C、沉淀、浓缩：在步骤B的上清滤液中加入有机溶剂乙醇和活性剂，搅拌均匀后沉淀，在5-20℃条件下沉淀0.5-2.5小时，超滤收集沉淀；
D、制粒、包衣、干燥：将步骤C中的沉淀与饲料用载体混合，利用制粒装置进行制粒，然后通过包衣装置对产品进行包衣，最后通过干燥装置进行干燥，制得胰酶。


2.根据权利要求1所述的一种从胰渣中提取饲料级胰酶的制备工艺，其特征在于：所述原料为粗酶粉提取血管紧张素后的冷冻胰渣，原料获取过程中采用有机溶剂乙醇进行过提取。


3.根据权利要求1所述的一种从胰渣中提取饲料级胰酶的制备工艺，其特征在于：所述步骤A溶解温度控制在5-20℃，蒸馏水与...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡青和，陈远庆，朱琳娜，
申请(专利权)人：上海欧耐施生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31