一种B群流脑fHbp-V2重组蛋白及其制备方法，疫苗组合物，用途技术

本发明专利技术提供了一种B群流脑fHbp‑V2重组蛋白及其制备方法，疫苗组合物，用途，所述疫苗抗原蛋白基因来自中国流行的B群流脑菌株，所述抗原蛋白免疫小鼠可以诱导产生平均滴度为102600的结合抗体反应和针对fHbp‑V2和fHbp‑V3的B群流脑菌株的杀菌抗体反应，可以用来预防fHbp‑V2和fHbp‑V3基因的B群流脑菌株导致的感染。

A recombinant fhbp-v2 protein of group B cerebrospinal fluid and its preparation method, vaccine composition, use

【技术实现步骤摘要】
一种B群流脑fHbp-V2重组蛋白及其制备方法，疫苗组合物，用途
本专利技术属于疫苗领域，具体涉及一种B群流脑fHbp-V2重组蛋白，该重组蛋白的氨基酸序列，编码该重组蛋白的基因，包含该重组蛋白的疫苗组合物，该重组蛋白的制备方法，该重组蛋白在制备预防脑脊髓膜炎或菌血症疾病的疫苗中的用途。
技术介绍
流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)属于我国规定的乙类传染病，是一种由革兰氏阴性的奈瑟双球菌导致的以急性脑脊髓膜炎和败血症为主要症状的通过呼吸道传播的传染病，婴幼儿和青少年是发病的主要人群，脑膜炎奈瑟球菌通常不会导致疾病，以无症状的形式在人体的鼻咽部定植，在某些情况下可以导致脑脊髓膜炎和菌血症。我国流脑的发病率已经下降到了0.01/10万以下，中国疾控预防控制中心发布的2018年中国法定传染病数据显示中国的流脑发病率为0.0075/10万，致死率为8-15％。根据其荚膜多糖的性质可以将流脑分为13个血清群，其中A、B、C、W和Y血清群是主要的流行菌群，超过95％的流脑感染病例是由这些血清群感染导致的。其中A、C、W、Y群流脑的相应的荚膜多糖疫苗和多糖结合疫苗已经上市销售，用于预防这四种流脑血清群的感染。而B群流脑因为其荚膜多糖是人体细胞的唾液酸酰基蛋白的类似物导致其免疫原性低，不能用于研究B群流脑疫苗。fHbp是位于流脑外膜的一种可以结合H因子的脂蛋白，H因子在补体系统中具有重要的作用，fHbp可以通过结合H因子的方式逃避免疫系统对流脑菌株的杀伤作用，是一种重要的B群流脑疫苗抗原。根据fHbp的蛋白序列，fHbp主要分为3个变异群V1、V2和V3，每个变异群内fHbp抗原的同源性为91.6-99％，不同变异群间fHbp抗原的同源性最低为62.8％。根据中国疾控中心关于B群流脑的研究数据显示中国与欧美地区流行B群流脑菌株的fHbp基因是不同的，欧美地区流行菌株的fHbp基因主要是V1，占流行菌株的70％，中国流行B群流脑菌株的fHbp基因主要是V2。欧美地区已经有2个上市的B群流脑疫苗产品，一个疫苗包含两种fHbp抗原蛋白，分别是fHbp-V1.45和fHbp-V3.55，另一个疫苗也包含fHbp-V1.1的蛋白，这三种fHbp的蛋白在中国B群流脑菌株中均未发现，所以筛选中国流行B群流脑菌株的fHbp抗原蛋白对于研制符合中国B群流脑流行情况的疫苗具有重要作用。
技术实现思路
本专利技术提供一种B群流脑fHbp-V2重组蛋白，具有如seqIDNO.1所示的氨基酸序列。本专利技术提供一种B群流脑fHbp-V2基因序列，编码如权利要求1所述B群流脑fHbp-V2重组蛋白。优选的，上述的B群流脑fHbp-V2基因序列，其核苷酸序列如seqIDNO.2所示。优选的，上述的B群流脑fHbp-V2基因序列，根据大肠杆菌的密码子偏好性进行密码子优化后合成后的核苷酸序列如seqIDNO.3所示。本专利技术提供一种疫苗组合物，其特征在于，包括上述的B群流脑fHbp-V2重组蛋白及作为佐剂的氢氧化铝、完全弗氏佐剂、或不完全弗氏佐剂。优选的，所述的B群流脑fHbp-V2重组蛋白含量为200ug/ml。优选的，所述氢氧化铝佐剂的含量为1mg/ml。本专利技术提供上述B群流脑fHbp-V2重组蛋白抗原在制备预防脑脊髓膜炎或菌血症疾病的疫苗中的用途。本专利技术提供一种上述B群流脑fHbp-V2重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：获取基因序列：从中国疾控中心保存的B群流脑的fHbp基因亚变异型V2.18菌株通过PCR基因扩增的方法获取如seqIDNO.2所示的fHbp-V2基因的核苷酸序列，其中用于扩增的PCR引物分别为：上游引物：TGACCTGCCTCATTGATGC，下游引物：GCCGTCCGAACACGATAATTTACCG；密码子优化：对如seqIDNO.2所示的fHbp基因的核苷酸序列用lasergene软件进行大肠杆菌密码子偏好性优化合成获得如seqIDNO.3所述核苷酸序列；构建原核表达质粒：将经过密码子优化后的fHbp-V2基因与原核pET28a表达载体经Ncol和EcoRI限制性内切酶双酶切，基因片段回收后用T4DNA连接酶进行连接，连接产物转化DH5a感受态细胞，培养，鉴定；构建表达菌株：构建成功的克隆转化BL21(DE3)表达感受态细胞诱导，培养，诱导表达，并用SDS-PAGE蛋白电泳鉴定菌体蛋白的表达；筛选表达量高的菌株；fHbp-V2重组蛋白的表达和纯化：将表达量高的菌株进行培养、收集、破碎、纯化获得fHbp-V2重组蛋白。本专利技术涉及的fHbp-V2重组蛋白抗原基因序列来源中国流行的B群流脑的菌株，菌株的fHbp基因属于亚变异型V2.18(Variant2.18，来自于中国疾病预防控制中心)，抗原基因根据大肠杆菌的密码子偏好性进行密码子优化合成后克隆到原核表达载体pET28a后，表达纯化后获得B群流脑fHbp-V2重组蛋白抗原，获得的fHbp-V2抗原的免疫血清能产生针对fHbp-V2和fHbp-V3的B群流脑菌株的杀菌抗体，效果显著。本专利技术的fHbp-V2重组蛋白抗原可诱导针对B群流脑fHbp-V3菌株的交叉杀菌抗体反应，可以用于预防B群流脑fHbp-V2和fHbp-V3菌株的感染。本专利技术的优点为筛选获得的fHbp-V2重组蛋白抗原基因来自中国流行的B群流脑菌株，可以用于预防中国B群流脑菌株的流行。附图说明图1：fHbp-V2基因序列双酶切的DNA电泳图；图2：pET28a载体双酶切的DNA电泳图；图3：fHbp-V2基因原核表达蛋白菌株的表达情况的SDS-PAGE图；图4：纯化后的fHbp-V2重组蛋白的SDS-PAGE图；图5：fHbp-V2重组蛋白免疫血清诱导产生的结合抗体反应；图6：fHbp-V2重组蛋白免疫血清诱导产生的杀菌抗体反应；具体实施方式为使本领域技术人员更好地理解本专利技术的技术方案，下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步详细描述。本专利的实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件进行。实施例1.fHbp-V2原核表达质粒的构建1.1.获取基因序列从中国疾控中心保存的B群流脑的fHbp基因的亚变异型V2.18菌株通过常规PCR基因扩增的方式获取如seqIDNO.2所示的fHbp-V2基因的核苷酸序列，用于扩增的PCR引物分别为：上游引物：TGACCTGCCTCATTGATGC，下游引物：GCCGTCCGAACACGATAATTTACCG，PCR条件为95℃预变性5min；95℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸60s；30个循环；72℃后延伸5min；1.2密码子优化：为了更好的表达目的蛋白，去本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种B群流脑fHbp-V2重组蛋白，其特征在于，具有如seq ID NO.1所示的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种B群流脑fHbp-V2重组蛋白，其特征在于，具有如seqIDNO.1所示的氨基酸序列。


2.一种B群流脑fHbp-V2基因序列，其特征在于，编码如权利要求1所述B群流脑fHbp-V2重组蛋白。


3.如权利要求2所述的B群流脑fHbp-V2基因序列，其特征在于，其核苷酸序列如seqIDNO.2所示。


4.如权利要求2所述的B群流脑fHbp-V2基因序列，其特征在于，根据大肠杆菌的密码子偏好性进行密码子优化后合成后的核苷酸序列如seqIDNO.3所示。


5.一种疫苗组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的B群流脑fHbp-V2重组蛋白及作为佐剂的氢氧化铝、完全弗氏佐剂、或不完全弗氏佐剂。


6.如权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的B群流脑fHbp-V2重组蛋白含量为200ug/ml。


7.如权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在于，所述氢氧化铝佐剂的含量为1mg/ml。


8.如权利要求1所述的B群流脑fHbp-V2重组蛋白抗原在制备预防脑脊髓膜炎或菌血症疾病的疫苗中的用途。


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【专利技术属性】
技术研发人员：刘建东，张静飞，徐颖之，张敬仁，刘建凯，郑海发，
申请(专利权)人：北京民海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11