本发明专利技术公开了一种检测黄曲霉毒素的电化学传感器，该传感器是基于黄曲霉毒素可与乙酰胆碱酯酶活性位点发生非共价键结合可以抑制该酶的活性的原理，在丝网印刷电极表面修饰上普鲁士蓝‑石墨烯复合物和纳米金‑壳聚糖的复合物，然后在修饰好的电极上滴加乙酰胆碱酯酶，从而得到可以检测黄曲霉毒素的电化学传感器。该传感器操作简单、成本低廉、检测灵敏度高，且相对于传统检测方法而言，其反应时间短，样品和试剂消耗量少，稳定性高，便于携带可用于实际样品的现场检测，符合我国黄曲霉毒素快速检测技术发展和国际化要求。
An electrochemical sensor for aflatoxin detection
【技术实现步骤摘要】
一种检测黄曲霉毒素的电化学传感器
本专利技术涉及一种检测黄曲霉毒素的电化学传感器，属于生物传感器领域。
技术介绍
黄曲霉毒素(AFs)是一种毒性极强的霉菌毒素且具有高致畸性和高致突变性，其在谷物，花生，玉米，棉籽粕、豆粕等中普遍存在，在田间和仓储过程中均能生成黄曲霉毒素。黄曲霉毒素被国际癌症研究机构划定为I类致癌物，对人和家禽家畜危害极大，其中黄曲霉毒素B1(AFB1)毒性最强，其毒性是砒霜的67倍。目前针对黄曲霉毒素的检测技术包括酶联免疫法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱法、薄层色谱法、液相色谱-质谱联用法等。其中酶联免疫法特异性好，但是需要制备特异性抗体，假阳性较高；大型仪器法往往需要繁琐的前处理步骤和昂贵的仪器，不适用于田间的快速检测；薄层色谱法的灵敏度和重复性较差，定量不准确。
技术实现思路
本专利技术克服了上述现有技术的不足，提供一种检测黄曲霉毒素的电化学传感器，该传感器是基于黄曲霉毒素可与乙酰胆碱酯酶活性位点发生非共价键结合可以抑制该酶的活性的原理，在丝网印刷电极表面修饰上普鲁士蓝-石墨烯复合物和纳米金-壳聚糖的复合物，然后在修饰好的电极上滴加乙酰胆碱酯酶，从而得到可以检测黄曲霉毒素的电化学传感器。一种检测黄曲霉毒素的电化学传感器，包括乙酰胆碱酯酶修饰电极，所述乙酰胆碱酯酶修饰电极包括由丝网印刷电极和沉积在丝网印刷电极表面的普鲁士蓝-石墨烯复合物、纳米金-壳聚糖的复合物构成的复合电极，以及附着在上述复合电极表面的乙酰胆碱酯酶；所述丝网印刷电极包括一印制电极的基片、基片上印制的外部绝缘层和三根电极引线；所述的基片上印制有三个电极，一个工作电极：碳电极；一个对电极：碳电极，直径3mm；和一个参比电极：Ag/AgCl电极，各电极对应连接有一电极引线。制备上述检测黄曲霉毒素的电化学传感器的制备方法，包括如下步骤：(1)制备普鲁士蓝-石墨烯复合物溶液和纳米金-壳聚糖的复合物溶液；(2)清洗活化丝网印刷电极，得到预处理的丝网印刷电极；(3)取10μL步骤(1)制备得到的普鲁士蓝-石墨烯复合物溶液滴加到步骤(2)预处理的丝网印刷电极上，晾干，另取10μL步骤(1)制备得到的纳米金-壳聚糖的复合物溶液滴加到步骤(2)预处理的丝网印刷电极上，晾干，得到纳米金/壳聚糖/普鲁士蓝/石墨烯/丝网印刷电极(AuNps/CS/PB/GR/SPCE)；(4)取3-5μL浓度为0.02U/μL乙酰胆碱酯酶溶液滴加到步骤(3)所得的纳米金/壳聚糖/普鲁士蓝/石墨烯/丝网印刷电极上，4℃干燥，得到检测黄曲霉毒素的电化学传感器。进一步的，上述步骤(1)中所述普鲁士蓝-石墨烯复合物溶液的制备方法，包括如下步骤：S1将2-3ml浓度为4mg/ml石墨烯分散液在室温搅拌条件下加到4-5ml的含6mgFeCl3·6H2O、8mgK3Fe(CN)6、37mgKCl的水溶液中，用HCl调节其pH为1.5，获得混合液；S2磁力搅拌混合液24h，将混合液离心清洗几次后，40℃真空干燥12h，得到普鲁士蓝-石墨烯复合物；S3称取步骤S2获得的普鲁士蓝-石墨烯复合物10mg溶于0.5ml的蒸馏水中，获得普鲁士蓝-石墨烯复合物溶液。进一步的，上述步骤(1)中所述的纳米金-壳聚糖的复合物溶液的制备方法，包括如下步骤：SS1二次蒸馏水与1-1.2％氯金酸溶液按照25:2的体积比混合、煮沸；SS2去2-2.5ml1％柠檬酸钠快速加入回流的步骤SS1中制备的氯金酸溶液中，溶液的颜色由浅黄变为深红时，获得含有零价纳米金粒子的溶液；SS3步骤SS2中获得的含有零价纳米金粒子溶液通过醋酸纤维素膜过滤，获得纳米金溶液，储藏在4℃冰箱中备用；SS4将0.5％wt的壳聚糖溶液与步骤SS3制成的纳米金溶液混合，搅拌1h，获得纳米金-壳聚糖复合物溶液。进一步的，上述步骤(2)中所述清洗活化丝网印刷电极的方法，包括如下步骤：SSS1将丝网印刷碳电极放入盛有1mMNaOH溶液的小烧杯中超声清洗5分钟，超纯水清洗，氮气吹干；SSS2将上述经过步骤SSS1处理过的电极放入盛有1mMHCl溶液的小烧杯中超声清洗5分钟，超纯水清洗，氮气吹干；SSS3用无水乙醇清洗上述经过步骤SSS2处理的电极，氮气吹干；SSS4将经过步骤SSS3处理的电极放入pH＝5的磷酸盐缓冲液中进行电流-时间曲线扫描300s，之后，进行循环伏安曲线扫描，直至性能稳定，即可完成对丝网印刷电极的清洗活化。进一步的，上述检测黄曲霉毒素的电化学传感器检测黄曲霉毒素的方法，包括如下步骤：①筛选最佳测定条件：分别向纳米金/壳聚糖/普鲁士蓝/石墨烯/丝网印刷电极上负载0.1U、0.15U、0.20U、0.25U、0.0.3U、0.35U、0.40U的乙酰胆碱酯酶的酶量，对其电流值进行检测，筛选出最佳酶负载量；利用不同pH值的磷酸盐缓冲液配置pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的1.0mmol/L硫代乙酰胆碱(ATC1)底液，将上述检测黄曲霉毒素的电化学传感器没入配置的硫代乙酰胆碱(ATC1)底液中，测定电流值，筛选出最佳pH值；使用同一种农药孵育上述检测黄曲霉毒素的电化学传感器，分别控制孵育时间为2min、4min、6min、8min、10min、12min、14min、16min、18min、20min，测定电流值，筛选最佳孵育时间；②在步骤①筛选的最优条件下，对不同浓度的黄曲霉毒毒素进行电流检测，并分别建立了黄曲霉毒素浓度与抑制率之间的线性关系，得不同浓度的黄曲霉毒素与农药的抑制率之间的线性回归方程；③称取1-5g待测样品，使用1-5ml80％甲醇溶液振荡萃取40-45min，离心保留上清液，上清液和PBS缓冲液按照1:5的体积比混合稀释，获得待测溶液；④使用上述的检测黄曲霉毒素的电化学传感器测定步骤③获得的待测溶液，依据步骤②获得的线性方程，即可获得样品中黄曲霉毒素的含量。有益效果：(1)本专利技术利用石墨烯材料容易分散、比表面积大，对电活性物质及生物分子的高负载量，提供更均匀、更大的电活性位点分布等优点，与纳米金粒子的生物相容性好和加速电子传输速率等优点相结合，制备复合纳米材料修饰在丝网印刷电极表面，有效提高所制备传感器的灵敏度。(2)利用乙酰胆碱酯酶与黄曲霉毒素的抑制作用，易于实现检测仪器的便携和在线检测，且操作简单分析速度快。(3)丝网印刷电极轻巧，可一次性使用，将丝网印刷电极用于乙酰胆碱酯酶生物传感器，更加适合于黄曲霉毒素的快速检测。(4)本专利技术制备的检测黄曲霉毒素的电化学传感器操作简单、成本低廉、检测灵敏度高，且相对于传统检测方法而言，其反应时间短，样品和试剂消耗量少，稳定性高，便于携带可用于实际样品的现场检测，符合我国黄曲霉毒素快速检测技术发展和国际化要求。附图说明图1纳米金-壳聚糖-普鲁士蓝-石墨烯复合物的500nm本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测黄曲霉毒素的电化学传感器，其特征在于，包括乙酰胆碱酯酶修饰电极，所述乙酰胆碱酯酶修饰电极包括由丝网印刷电极和沉积在丝网印刷电极表面的普鲁士蓝-石墨烯复合物、纳米金-壳聚糖的复合物构成的复合电极，以及附着在上述复合电极表面的乙酰胆碱酯酶。/n
【技术特征摘要】
1.一种检测黄曲霉毒素的电化学传感器，其特征在于，包括乙酰胆碱酯酶修饰电极，所述乙酰胆碱酯酶修饰电极包括由丝网印刷电极和沉积在丝网印刷电极表面的普鲁士蓝-石墨烯复合物、纳米金-壳聚糖的复合物构成的复合电极，以及附着在上述复合电极表面的乙酰胆碱酯酶。
2.制备如权利要求1所述的检测黄曲霉毒素的电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备普鲁士蓝-石墨烯复合物溶液和纳米金-壳聚糖的复合物溶液；
(2)清洗活化丝网印刷电极，得到预处理的丝网印刷电极；
(3)取步骤(1)制备得到的普鲁士蓝-石墨烯复合物溶液滴加到步骤(2)预处理的丝网印刷电极上，晾干，另取步骤(1)制备得到的纳米金-壳聚糖的复合物溶液滴加到步骤(2)预处理的丝网印刷电极上，晾干，得到纳米金/壳聚糖/普鲁士蓝/石墨烯/丝网印刷电极；
(4)取乙酰胆碱酯酶溶液滴加到步骤(3)所得的纳米金/壳聚糖/普鲁士蓝/石墨烯/丝网印刷电极上，4℃干燥，得到检测黄曲霉毒素的电化学传感器。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述普鲁士蓝-石墨烯复合物溶液的制备方法，包括如下步骤：
S1将2-3ml浓度为4mg/ml石墨烯分散液在室温搅拌条件下加到4-5ml的含5-6mgFeCl3·6H2O、6-8mgK3Fe(CN)6、35-37mgKCl的水溶液中，用HCl调节其pH为1.5，获得混合液；
S2搅拌混合液，将混合液离心清洗几次后，干燥，得到普鲁士蓝-石墨烯复合物；
S3称取步骤S2获得的普鲁士蓝-石墨烯复合物8-10mg溶于0.4-0.5ml的蒸馏水中，获得普鲁士蓝-石墨烯复合物溶液。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的纳米金-壳聚糖的复合物溶液的制备方法，包括如下步骤：
SS1二次蒸馏水与1-1.2％氯金酸溶液按照25:2的体积比混合、煮沸；
SS2取2-2.5ml1％柠檬酸钠快速加入回流的步骤SS1中制备的氯金酸溶液中，溶液的颜色由浅黄变为深红时，获得含有零价纳米金粒子的溶液；
SS3步骤SS2中获得的含有零价纳米金粒子溶液过滤，获得纳米金溶液，储藏在4℃冰箱中备用；
SS4将0.5％wt的壳聚糖溶液与步骤SS3制成的纳米金溶液混合，搅拌，获得纳米金-壳聚糖复合物溶液。
【专利技术属性】
技术研发人员：董燕婕，王怡然，赵善仓，范丽霞，王磊，
申请(专利权)人：山东省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。