一种HPLC法测定十字花科蔬菜中萝卜硫素和莱菔素的方法技术

本发明专利技术提供了一种HPLC法测定十字花科蔬菜中萝卜硫素和莱菔素的方法。该方法将十字花科蔬菜中的萝卜硫素和莱菔素先经过pH 5.2磷酸缓冲液水解，用乙酸乙酯提取，提取液浓缩后定容，用配有紫外检测器的高效液相色谱仪分别在波长254nm和225nm处测定，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量。本方法所采用的仪器目前在各个实验室中应用广泛，易于推广，具有较强的适用性，对于提升蔬菜产品的营养品质和保健功能具有重要意义，同时为十字花科蔬菜的育种和相关基因克隆提供理论依据。

【技术实现步骤摘要】
一种HPLC法测定十字花科蔬菜中萝卜硫素和莱菔素的方法
本专利技术涉及分析检测
，具体的说是一种HPLC法测定十字花科蔬菜中萝卜硫素和莱菔素的方法。
技术介绍
萝卜硫素和莱菔素均属于异硫氰酸脂类物质，是目前公认的防癌抗癌效果最好的天然产物之一，对肝癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、前列腺癌和胃癌有明显的阻断作用。此外，萝卜硫素和莱菔素还具有抗炎抑菌、提高机体抗氧化能力和免疫力等药理作用。因此，萝卜硫素和莱菔素被视为评价十字花科蔬菜品质和营养保健价值的重要指标。然而，目前尚未建立十字花科蔬菜中萝卜硫素和莱菔素含量的分析检测方法。CN201410239297.7公开了一种萝卜硫素提取物中萝卜硫素的HPLC定量检测方法，该方法不需要对萝卜硫素提取物进行前处理且仅仅检测萝卜硫素一种化合物，其检测方法较为简单，不适合十字花科蔬菜中萝卜硫素和莱菔素含量的检测。因此，亟需制定出一套基于HPLC技术的检测十字花科蔬菜中萝卜硫素和莱菔素含量的检测方法，对于提升蔬菜产品的营养品质和保健功能具有重要意义，同时为十字花科蔬菜的育种和相关基因克隆提供理论依据。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供了一种HPLC法测定十字花科蔬菜中萝卜硫素和莱菔素的方法。该方法将十字花科蔬菜中的萝卜硫素和莱菔素先经过磷酸缓冲液水解，用乙酸乙酯提取，提取液浓缩后定容，用配有紫外检测器的高效液相色谱仪分别在波长254nm和225nm处测定，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量。本方法所采用的仪器目前在各个实验室中应用广泛，易于推广，具有较强的适用性，对于提升蔬菜产品的营养品质和保健功能具有重要意义，同时为十字花科蔬菜的育种和相关基因克隆提供理论依据。本专利技术的技术方案是：一种HPLC法测定十字花科蔬菜中萝卜硫素和莱菔素的方法，其特征是，1)前处理称取十字花科蔬菜匀浆样品于离心管中，加入pH5.2磷酸缓冲液，混匀，置于20-30℃水解，然后加入乙酸乙酯萃取，离心，取上层有机相，置于旋蒸瓶中，再重复萃取1-2次，合并萃取液，利用旋转蒸发仪浓缩至近干，用甲醇水溶液(甲醇:水＝7:3(V/V))定容，过滤膜，得到试样溶液待HPLC分析测定；2)HPLC分析的色谱条件色谱柱：C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，或性能相当者；流动相A：0.1％磷酸-水溶液；流动相B：乙腈；检测波长：225nm(莱菔素)；254nm(萝卜硫素)；柱温：30℃；流速：1mL/min；进样量：10μL；梯度洗脱条件，见表1；3)标准曲线建立配制萝卜硫素和莱菔素的标准工作溶液，以保留时间定性，外标法定量，通过标准工作液的浓度与相应的峰面积绘制标准曲线；4)检测试样溶液HPLC测定，以保留时间定性，外标法定量，以试样溶液中萝卜硫素或莱菔素的峰面积代入标准曲线，从而得到相应的萝卜硫素或莱菔素的浓度。所述的十字花科蔬菜包括萝卜、大白菜、西兰花、小白菜、卷心菜等。优选的，前处理步骤为：称取十字花科蔬菜匀浆样品1.000g于50mL离心管中，加入pH5.2磷酸缓冲液3mL，混匀，置于25℃水解1h，然后加入乙酸乙酯40mL，萃取30min，以4500r/min离心5min，取上层有机相，置于旋蒸瓶中，再重复萃取2次，合并萃取液，利用旋转蒸发仪浓缩至近干，用1mL甲醇水溶液(甲醇:水＝7:3(V/V))定容，过0.22μm滤膜，待HPLC分析测定。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术首次同时对萝卜硫素和莱菔素进行检测，前处理简单，添加平均回收率在76.84％～114.42％之间，萝卜硫素的检出限为0.5μg/mL，莱菔素的检出限为0.4μg/mL。2、本方法所采用的仪器目前在各个实验室中应用广泛，易于推广，具有较强的适用性，对于提升蔬菜产品的营养品质和保健功能具有重要意义，同时为十字花科蔬菜的育种和相关基因克隆提供理论依据。附图说明图1为莱菔素标准溶液色谱图；图2为萝卜硫素标准溶液色谱图；图3为莱菔素的标准曲线；图4为萝卜硫素的标准曲线。具体实施方式一、检测方法1试剂与设备萝卜硫素标准品：CAS号4478-93-7，纯度≥95％；莱菔素标准品：CAS号592-95-0，纯度≥98％；乙腈、甲醇、乙酸乙酯：色谱纯；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸：分析纯。高效液相色谱仪Waterse2695：配有紫外检测器或二极管阵列检测器；色谱柱：C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；高速冷冻离心机；旋转蒸发仪；涡旋混合器；匀浆机；分析天平；0.22μm有机系滤膜。2试样制备采用四分法分取样品，取约200g新鲜样品于匀浆机中匀浆均匀，标明编号，置于-20℃条件下保存，备用。3提取称取蔬菜匀浆样品1.000g于50mL离心管中，加入pH5.2磷酸缓冲液3mL，混匀，置于25℃水解1h，然后加入乙酸乙酯40mL，萃取30min，以4500r/min离心5min，取上层有机相，置于旋蒸瓶中，再重复萃取2次，合并萃取液，利用旋转蒸发仪浓缩至近干，用1mL甲醇水溶液(甲醇:水＝7:3(V/V))定容，过0.22μm滤膜，待HPLC分析测定。4测定4.1色谱条件色谱柱：C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相A：0.1％磷酸-水溶液；流动相B：乙腈；检测波长：225nm(莱菔素)；254nm(萝卜硫素)；柱温：30℃；流速：1mL/min；进样量：10μL；梯度洗脱条件，见表1。表1梯度洗脱程序4.2色谱分析称取5mg(精确至0.1mg)萝卜硫素和莱菔素标准品，用甲醇溶解，转移至5mL容量瓶中，定容至刻度，得到质量浓度为1000mg/L萝卜硫素和莱菔素单标储备液。将莱菔素标准储备液用甲醇逐级稀释成300mg/L、200mg/L、100mg/L、60mg/L、30mg/L、10mg/L、5mg/L的标准工作溶液；将萝卜硫素标准储备液用甲醇逐级稀释成100mg/L、50mg/L、25mg/L、10mg/L、5mg/L的标准工作溶液。分别取标准溶液和试样溶液上机测定，以保留时间定性，外标法定量，通过标准工作液的浓度与相应的峰面积绘制标准曲线，以试样溶液中萝卜硫素或莱菔素的峰面积代入标准曲线，从而求得相应的萝卜硫素或莱菔素的浓度。5结果计算样品中的萝卜硫素与莱菔素含量按下式计算：X＝C×V/m式中：X──样品中萝卜硫素或莱菔素的含量，单位为微克每克(μg/g)。C──待测液中萝卜硫素或莱菔素的质量浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)。V──定容体积，单位为毫升(mL)。m──样品质量，单位为克(g)。备注：测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留三位有效数本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种HPLC法测定十字花科蔬菜中萝卜硫素和莱菔素的方法，其特征是，/n1)前处理/n称取十字花科蔬菜匀浆样品于离心管中，加入pH 5.2磷酸缓冲液，混匀，置于20-30℃水解，然后加入乙酸乙酯萃取，离心，取上层有机相，置于旋蒸瓶中，再重复萃取1-2次，合并萃取液，利用旋转蒸发仪浓缩至近干，用甲醇水溶液定容，过滤膜，得到试样溶液待HPLC分析测定；/n2)HPLC分析的色谱条件/n色谱柱：C18色谱柱，规格：250mm×4.6mm，5μm；/n流动相A：0.1％磷酸-水溶液；流动相B：乙腈；/n莱菔素检测波长：225nm；萝卜硫素检测波长：254nm；/n柱温：30℃；/n流速：1mL/min；/n进样量：10μL；/n3)标准曲线建立/n配制萝卜硫素和莱菔素的标准工作溶液，以保留时间定性，外标法定量，通过标准工作液的浓度与相应的峰面积绘制标准曲线；/n4)检测/n试样溶液HPLC测定，以保留时间定性，外标法定量，以试样溶液中萝卜硫素或莱菔素的峰面积代入标准曲线，从而得到相应的萝卜硫素或莱菔素的浓度。/n

【技术特征摘要】
1.一种HPLC法测定十字花科蔬菜中萝卜硫素和莱菔素的方法，其特征是，
1)前处理
称取十字花科蔬菜匀浆样品于离心管中，加入pH5.2磷酸缓冲液，混匀，置于20-30℃水解，然后加入乙酸乙酯萃取，离心，取上层有机相，置于旋蒸瓶中，再重复萃取1-2次，合并萃取液，利用旋转蒸发仪浓缩至近干，用甲醇水溶液定容，过滤膜，得到试样溶液待HPLC分析测定；
2)HPLC分析的色谱条件
色谱柱：C18色谱柱，规格：250mm×4.6mm，5μm；
流动相A：0.1％磷酸-水溶液；流动相B：乙腈；
莱菔素检测波长：225nm；萝卜硫素检测波长：254nm；
柱温：30℃；
流速：1mL/min；
进样量：10μL；
3)标准曲线建立
配制萝卜硫素和莱菔素的标准工作溶液，以保留时间定性，外标法定量，通过标准工作液的浓度与相应的峰面积绘制标准曲线；
4)检测
试样溶液HPLC测定，以保留时间定性，外标法定量，以试样溶液中萝卜硫素或莱菔素的峰面积代入标准曲线，从而得到相应的萝卜硫素或莱菔素的浓度。

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉涛，蔡达，赵玉华，刘俊华，秦宏伟，张潇，
申请(专利权)人：山东省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37