一种脂肪细胞冻存及复苏后间充质干细胞的培养方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体是一种脂肪细胞冻存及复苏后间充质干细胞的培养方法，通过将抽取出来的脂肪组织处理后深低温冻存，后期根据使用量复苏冻存脂肪组织培养脂肪间充质干细胞，细胞培养完成，鉴定合格后与复苏的脂肪组织共同移植，与现有的脂肪组织冻存和间充质干细胞培养方法相比，解决了多次抽脂和脂肪间充质干细胞培养问题，操作简单，无需组织及细胞过滤，使用DNaseⅠ解决脂肪间充质干细胞进入消化粘液中而无法分离的问题，获得的干细胞数量更多，整个分离过程无动物源性成分，安全性好，便于后续的研究应用。

A culture method of mesenchymal stem cells after cryopreservation and resuscitation of adipocytes

【技术实现步骤摘要】
一种脂肪细胞冻存及复苏后间充质干细胞的培养方法
本专利技术涉及生物
，具体是一种脂肪细胞冻存及复苏后间充质干细胞的培养方法。
技术介绍
近年来随着脂肪抽吸技术发展和人们对整形美容的接受度不断提高，自体脂肪组织作为一种理想的软组织填充材料，脂肪填充已成为医学美容领域最重要的技术方法之一，研究表明，移植脂肪组织的存活与脂肪组织内血管神经的再建联系紧密，而脂肪组织来源的干细胞不仅具有刺激血管生成的作用，还可恢复组织细胞的修复功能，促进细胞的再生，有效改善亚健康、早衰等疾病。但移植脂肪组织的低存活率和高吸收率是困扰脂肪移植在临床中广泛开展和应用的主要问题。目前提高脂肪成活率的理想方法是少量、反复、多次注射，重复的脂肪移植需要再次从患者体内抽脂，但是多次抽脂、移植不仅增加了患者的痛苦、增加了风险及手术费用，同时也加重了医生的工作负担，因此，针对以上现状，迫切需要开发一种脂肪细胞冻存及复苏后间充质干细胞的培养方法，以克服当前实际应用中的不足。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种脂肪细胞冻存及复苏后间充质干细胞的培养方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种脂肪细胞冻存及复苏后间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：步骤一：抽脂后，将脂肪组织置于含有保存液的采集瓶中，2-8℃及时运送回实验室，并对其进行编号；步骤二：将采集瓶置于生物安全柜无菌操作打开，将上层脂肪组织用25ml移液管转移入50ml离心管，每管20ml；步骤三：各离心管中分别加入适量含双抗的清洗液，轻柔吹打，反复吹打混匀后，补充生理盐水至45ml刻度，1300rpm、5min离心，离心后明显分层，最上层为油滴状液体，中间层为白色脂肪组织，最下层为生理盐水、少量结缔组织及红细胞等沉淀物，用5ml移液管移去上层油滴，用25ml移液管缓慢伸入到下层生理盐水中并吸弃生理盐水及沉淀物，重复上述操作数次；步骤四：将脂肪组织收集到一起，用组织剪将组织剪碎至1×1mm2，将组织块与冻存液以一定比例混合均匀，加入5ml冻存管，冻存管放入程序降温盒中，-80℃放置8小时后转入气相罐冻存；步骤五：将冻存管从气相罐中取出，立即放入37℃水浴中，不停晃动，使冻存脂肪组织在2分钟内快速化冻，待全部解冻后将冻存管从水浴中取出，擦干冻存管外的水，用酒精棉球擦拭消毒冻存管外壁后，将冻存管放入生物安全柜，无菌操作将冻存管在生物安全柜内打开盖子，将冻存脂肪组织移入50ml离心管，然后加入生理盐水，轻轻混匀，2000rpm、8min离心，弃上清，用生理盐水重悬组织，离心2000rpm、8min，弃上清；步骤六：将脂肪组织放入新的50mL离心管中，每管约含组织10mL，加入胶原酶Ⅰ2mL，DNAseⅠ2mL，补充生理盐水至20mL，吹打均匀，将离心管密封，放入37℃恒温摇床，145rpm震荡消化40min，消化结束后，在生物安全柜中加入适量生理盐水，1300rpm、5min离心，移液管吸弃上层未消化完全的组织及生理盐水，加适量生理盐水重悬离心管底部的细胞沉淀，1300rpm、5min离心，弃上清；步骤七：消化后的细胞加10ml间充质干细胞培养基重悬，根据细胞量接种于T175培养瓶中，培养瓶放入37℃、5％二氧化碳培养箱中，培养至第3天，进行第一次半换液，第6天根据实际情况进行半换或全换液，以后每隔3天全换液；步骤八：脂肪间充质干细胞传代培养。作为本专利技术进一步的方案：步骤八中，原代细胞融合度60％以上即可传P1代，接种密度为8000个/cm2，以后细胞融合度达80％以上即可继续传代。作为本专利技术进一步的方案：步骤三中，所述双抗清洗液的制备步骤包括：注射用青霉素和硫酸链霉素用注射用生理盐水配制成每毫升1万单位的储存液，即为1％的双抗储存液，500mL的注射用生理盐水加入5mL的双抗储存液，再加入2mL注射用硫酸庆大霉素，即配制成组织保存液或清洗液。作为本专利技术进一步的方案：步骤六中，所述胶原酶Ⅰ储存液的制备步骤包括：称取1g胶原酶Ⅰ，溶解于100mL生理盐水中，0.22μm滤膜过滤，即为1％(m/v)的胶原酶Ⅰ储存液。作为本专利技术进一步的方案：步骤六中，所述DNaseⅠ储存液的制备步骤包括：称取0.2gDNaseⅠ，溶解于100mL生理盐水中，0.22μm滤膜过滤，即为0.2％(m/v)的DNaseⅠ储存液。作为本专利技术进一步的方案：步骤三中，重复操作次数不少于三次。作为本专利技术进一步的方案：步骤四中，组织块与冻存液的混合比例为3:2。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1.本方法将抽取出来的脂肪组织处理后深低温冻存，后期根据使用量复苏冻存脂肪组织培养脂肪间充质干细胞，细胞培养完成，鉴定合格后与复苏的脂肪组织共同移植，与现有的脂肪组织冻存和间充质干细胞培养方法相比，解决了多次抽脂和脂肪间充质干细胞培养问题；2.操作简单，无需组织及细胞过滤，使用DNaseⅠ解决脂肪间充质干细胞进入消化粘液中而无法分离的问题，获得的干细胞数量更多；3.整个分离过程无动物源性成分，安全性好，便于后续的研究应用。附图说明图1为脂肪细胞冻存及复苏后间充质干细胞的培养方法中P2流式检测结果图。图2为脂肪细胞冻存及复苏后间充质干细胞的培养方法中P3流式检测结果图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。实施例1本专利技术实施例中，一种脂肪细胞冻存及复苏后间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：步骤一：抽脂后，将脂肪组织置于含有保存液的采集瓶中，2-8℃及时运送回实验室，并对其进行编号；步骤二：将采集瓶置于生物安全柜无菌操作打开，将上层脂肪组织用25ml移液管转移入50ml离心管，每管20ml；步骤三：各离心管中分别加入适量含双抗的清洗液，轻柔吹打，反复吹打混匀后，补充生理盐水至45ml刻度，1300rpm、5min离心，离心后明显分层，最上层为油滴状液体，中间层为白色脂肪组织，最下层为生理盐水、少量结缔组织及红细胞等沉淀物，用5ml移液管移去上层油滴，用25ml移液管缓慢伸入到下层生理盐水中并吸弃生理盐水及沉淀物，重复上述操作数次；步骤四：将脂肪组织收集到一起，用组织剪将组织剪碎至1×1mm2，将组织块与冻存液以一定比例混合均匀，加入5ml冻存管，冻存管放入程序降温盒中，-80℃放置8小时后转入气相罐冻存；步骤五：将冻存管从气相罐中取出，立即放入37℃水浴中，不停晃动，使冻存脂肪组织在2分钟内快速化冻，待全部解冻后将冻存管从水浴中取出，擦干冻存管外的水，用酒精棉球擦拭消毒冻存管外壁后，将冻存管放入生物安全柜，无菌操作将冻存管在生物安全柜内打开盖子，将冻存脂肪组织移入50ml离心管，然后加入生理盐水，轻轻混匀，2000rpm、8min离心，弃上清，用生理盐水重悬组织，离心2000rpm、8min，弃上清；步骤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脂肪细胞冻存及复苏后间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤一：抽脂后，将脂肪组织置于含有保存液的采集瓶中，2-8℃及时运送回实验室，并对其进行编号；/n步骤二：将采集瓶置于生物安全柜无菌操作打开，将上层脂肪组织用25ml移液管转移入50ml离心管，每管20ml；/n步骤三：各离心管中分别加入适量含双抗的清洗液，轻柔吹打，反复吹打混匀后，补充生理盐水至45ml刻度，1300rpm、5min离心，离心后明显分层，最上层为油滴状液体，中间层为白色脂肪组织，最下层为生理盐水、少量结缔组织及红细胞等沉淀物，用5ml移液管移去上层油滴，用25ml移液管缓慢伸入到下层生理盐水中并吸弃生理盐水及沉淀物，重复上述操作数次；/n步骤四：将脂肪组织收集到一起，用组织剪将组织剪碎至1×1mm

【技术特征摘要】
1.一种脂肪细胞冻存及复苏后间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：抽脂后，将脂肪组织置于含有保存液的采集瓶中，2-8℃及时运送回实验室，并对其进行编号；
步骤二：将采集瓶置于生物安全柜无菌操作打开，将上层脂肪组织用25ml移液管转移入50ml离心管，每管20ml；
步骤三：各离心管中分别加入适量含双抗的清洗液，轻柔吹打，反复吹打混匀后，补充生理盐水至45ml刻度，1300rpm、5min离心，离心后明显分层，最上层为油滴状液体，中间层为白色脂肪组织，最下层为生理盐水、少量结缔组织及红细胞等沉淀物，用5ml移液管移去上层油滴，用25ml移液管缓慢伸入到下层生理盐水中并吸弃生理盐水及沉淀物，重复上述操作数次；
步骤四：将脂肪组织收集到一起，用组织剪将组织剪碎至1×1mm2，将组织块与冻存液以一定比例混合均匀，加入5ml冻存管，冻存管放入程序降温盒中，-80℃放置8小时后转入气相罐冻存；
步骤五：将冻存管从气相罐中取出，立即放入37℃水浴中，不停晃动，使冻存脂肪组织在2分钟内快速化冻，待全部解冻后将冻存管从水浴中取出，擦干冻存管外的水，用酒精棉球擦拭消毒冻存管外壁后，将冻存管放入生物安全柜，无菌操作将冻存管在生物安全柜内打开盖子，将冻存脂肪组织移入50ml离心管，然后加入生理盐水，轻轻混匀，2000rpm、8min离心，弃上清，用生理盐水重悬组织，离心2000rpm、8min，弃上清；
步骤六：将脂肪组织放入新的50mL离心管中，每管约含组织10mL，加入胶原酶Ⅰ2mL，DNAseⅠ2mL，补充生理盐水至20mL，吹打均匀，将离心管密封，放入37℃恒温摇床，145rpm震荡消化40min，消化结束后，在生物安全柜中加入适量生理盐水，1300rpm、5min离心，移液管吸弃上层未消化完全的组织及生理盐水，加适量生理盐水重悬离心管底部的细胞沉淀，1300rpm、5min离心...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱艳丽，宋少锐，聂苏秦，张博，晁若瑜，
申请(专利权)人：陕西九州细胞基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61