含维生素C的促进脐带间充质干细胞增殖的培养基制造技术

本发明专利技术公开了维生素C在促进脐带间充质干细胞增殖且不影响干细胞活性、活率和分化老化中的应用，在制备促进脐带间充质干细胞增殖且不影响干细胞活性、活率和分化老化的培养基中的应用。本发明专利技术发现，在使用现有干细胞培养基使干细胞贴壁后，加入AA(无需增加其它的复杂成分)，即可以促进干细胞的增殖，通过数据也证明即使AA能显著在短时间内提高干细胞的数量，但干细胞的活性，活率以及细胞周期均与不使用添加的对照培养基无差异，说明AA的补充仅会提高细胞增殖，而不会降低细胞活性，降低细胞活率，促进干细胞老化。

Culture medium containing vitamin C for promoting the proliferation of umbilical cord mesenchymal stem cells

【技术实现步骤摘要】
含维生素C的促进脐带间充质干细胞增殖的培养基
本专利技术涉及维生素C在促进脐带间充质干细胞增殖且不影响干细胞活性、活率和分化老化中的应用。以及含维生素C的促进脐带间充质干细胞增殖的培养基，属于细胞培养

技术介绍
目前，干细胞作为一种新的治疗手段正在广泛地应用于多种疾病的临床试验研究当中，绝大多数的临床试验均证明干细胞能够较好地改善病症。然而，干细胞在未来临床应用中则要解决如何在更短时间内增殖到符合使用需求的细胞数量，同时保证大规模扩增后间充质干细胞仍然保持良好的细胞活性，并且增殖的细胞保持多潜能性和归巢能力，从而保证干细胞的医用价值不打折扣。间充质干细胞是成体干细胞的一种，即在成体中一类具有可分化可增殖的细胞。目前中国有51项利用干细胞进行的临床试验，其中脐带间充质干细胞项目占总项目的比例超过51％。因此，对于如何有效快速增殖脐带间充质干细胞，同时保证细胞的活性和稳定性是目前亟待解决的问题。细胞周期是指通过细胞分裂产生的新细胞的生长开始到下一次细胞分裂形成子细胞结束为止所经历的过程。细胞周期可以分为四个时期，细胞按照G1-S-G2-M路线正常运转。G0/G1期被认为是细胞静默和生长期，S期是DNA合成期，G2期是有丝分裂准备期，M期为使染色体等分到两子细胞的过程。干细胞的相对静止(即大部分处于G0/G1期)可以防止细胞未成熟耗竭(Prematureexhaustion)。目前有研究发现脐带间充质干细胞在传代培养到第33代，较第3代细胞的G0/G1减少17.9％、S+G2/M增加103.4％、细胞凋亡率增加316.7％，差异均有显著性意义(P<0.01)(ChaoX,Ji-dongL,JingL,Wen-zheM,Yang-qiuL.Biologicalactivityandrestrictionofhumanumbilicalcordmesenchymalstemcellsduringlong-termcultureinvitro.JClinRehabilTissueEngReserach2011；15:1750–4.doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.10.009.)。另外，第12代脐带间充质干细胞的增殖能力和向成脂肪细胞分化诱导率显著下降，而向成骨细胞分化诱导率及细胞衰老率显著上升(程梅,王洪岩,于大海,李华伟,杜鹏程,魏负禾,张颢,邱林,马军.脐带间充质干细胞长期体外培养的生物学特性及遗传稳定性[J].中国生物制品学杂志,2014,27(3):356-360.)。因此，虽然细胞传代能增加细胞的数量，但细胞的老化和分化也随着细胞增殖而加快。因此，本专利技术期望通过筛选发现一种/多种能够促进脐带间充质干细胞增殖且不影响细胞活性和分化的配方，该配方将有助于突破干细胞应用的瓶颈。维生素是人为维持正常的生理功能而必须从食物中获得的一类微量有机物质，在人体生长、代谢、发育过程中发挥着重要的作用。维生素C(Ascrobicacid,AA)是生命必须但人体无法合成的必要水溶性维生素。AA通过水解最后形成代谢产物(CaOx)(LinsterCL,VanSchaftingenE.VitaminC:Biosynthesis,recyclinganddegradationinmammals.FEBSJ2007；274:1–22.doi:10.1111/j.1742-4658.2006.05607.x.)。AA缺乏会导致坏血症(scurvy)。已知AA能促进成骨、肌细胞增殖、成软骨、细胞外基质的构成和胶原的形成(FranceschiT.TheRoleofAscorbicAcidinMesenchymalDifferentiation.Nutrition1992；50:65–70.)(D’AnielloC,CermolaF,PatriarcaEJ,MinchiottiG.VitaminCinStemCellBiology:ImpactonExtracellularMatrixHomeostasisandEpigenetics.StemCellsInt2017；2017:1–16.doi:10.1155/2017/8936156.)。近年来，成体细胞重编程研究中发现，AA通过调节组氨酸去甲基双加氧酶(histonedemethylatingdioxygenases)的活性促进诱导多能干细胞的产生(ChenJ,GuoL,ZhangL,WuH,YangJ,LiuH,etal.VitaminCmodulatesTET1functionduringsomaticcellreprogramming.NatGenet2013:1–7.doi:10.1038/ng.2807.)。在已公开的干细胞培养基配方中大部分含有AA，例如公开号为CN103243071A的专利技术专利中陈述培养基中含有176.13mg/L的AA。在康宁的α-MEM培养基中含有50mg/L的AA。在公开号为CN104805054A的专利技术专利中表述含有20-100μg/mL的AA。在CN108611320A的专利技术专利申请中表述培养基配方含有10mg/L的AA。在公开号为CN108676773A的专利技术专利申请中表述培养基配方含有10-100mg/L的AA。在公开号为CN108721606A的专利技术专利申请中表述产品含有10-50μg/mL的AA。在公开号为CN108938618A的专利技术专利申请中表述AA的施用浓度是10μM-1000μM，优选地100μM-500μM；这说明不同浓度的AA对于干细胞的增殖发挥着重要作用(但不能说明细胞增殖是仅由AA带来的，部分培养基虽能延缓细胞衰老、分化等，但不能说明该作用是仅由AA带来的)。另一方面，在BIBiologicalIndustries的间质干细胞成骨诱导分化培养基和成软骨诱导分化培养基中分别含有70.4μg(20mmol/L,400μL)和52.8μg(20mmol/L,300μL)的AA，这说明不同分化方向需要浓度不同的AA。但是，以上所涉及的培养基中除了AA外还含有其它非常复杂且各异的物质，例如：在公开号为108611320A的专利技术专利申请中描述“该抗衰老的干细胞培养基包括：低糖α-MEM培养基、胎牛血清、miR-705antagomir、维生素C、谷氨酰胺、青霉素和链霉素。该抗衰老的干细胞培养基能够延缓长期体外传代扩增所致的间充质干细胞衰老和功能下降”。又如在公开号为CN108676773A的专利技术专利申请中描述“基础培养液和外源添加物，所述外源添加物为：葡聚糖为5-15g/L，脂类浓缩剂为0.1-0.5mL/L,氢化可的松为0.05-5μg/L，地塞米松为0.1-10μg/L，亚硒酸钠为1-5μg/L，β-巯基乙醇为10-50μM，维生素E为10-50μg/L，转铁蛋白为1-20mg/L,胰岛素5-50μg/L，生长激素(GH)为10-50μg/L，谷胱甘肽10-50μg/L，非必需氨基酸为1％”。再如在公开号为109790516A的专利技术专利申请中描述“包含5-10％的FBS和NAC(N-乙酰半胱氨酸)的DM本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.维生素C在促进脐带间充质干细胞增殖且不影响干细胞活性、活率和分化老化中的应用，或在制备促进脐带间充质干细胞增殖且不影响干细胞活性、活率和分化老化的培养基中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.维生素C在促进脐带间充质干细胞增殖且不影响干细胞活性、活率和分化老化中的应用，或在制备促进脐带间充质干细胞增殖且不影响干细胞活性、活率和分化老化的培养基中的应用。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：维生素C作为唯一有效成分在促进脐带间充质干细胞增殖且不影响干细胞活性、活率和分化老化中的应用。维生素C作为唯一有效成分在制备促进脐带间充质干细胞增殖且不影响干细胞活性、活率和分化老化的培养基中的应用。


3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：维生素C的添加浓度为0.01～10mg/mL。


4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：维生素C的添加浓度为0.1mg/mL。


5.含维生素C的促进脐带间充质干细胞增殖的培养基，其特征在于：由基础培养基、维生素C和血小板分裂物组成，其中，维生素C的浓度为0.01～10mg/mL，血小板分裂物占基础培养基质量的5％；
或：由基础培养基，维生素C，血小板分裂物，以及维生素E或维生素K或萝卜硫素组成，其中，维生素C的浓度为0.01～10mg/mL，血小板分裂物占基础培养基质量的5％。


6.根据权利要求5所述的含维生素C的促进脐带间充质干细胞增殖的培养基，其特征在于：所述维生素C的浓度为0.1mg/mL。


7.根据权利要求5所述的含维生素C的促进脐带间充质干细胞增殖的培养基，其特征在于：所述基础培养基选自...

【专利技术属性】
技术研发人员：李一佳，杜书文，李玉静，王苗，孟繁敏，郑伟涛，
申请(专利权)人：华辰未来北京生物医学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11