一种低温冻存保存液制造技术

本发明专利技术提供了一种低温冻存保存液，包括重量百分比的组份如下：3‑15%的可食用保存物质、85‑97%的生理盐水，所述可食用保存物质选自甘油、葡萄糖、蜂蜜、山梨糖醇、蔗糖、脱脂牛奶中的一种或多种。在菌群移植过程中，使用甘油来保存菌群，一方面可能会患者头晕、恶心及腹泻等症状；另一方面，去除菌液中的甘油时需要反复离心洗涤，这既使操作步骤变得繁琐又使得菌体因为曝氧及机械损伤等引起活菌比例下降。本发明专利技术采用可食用保存物质，降低了患者在菌群移植过程的不良反应，同时避免了去除菌液中甘油的繁琐过程，确保活菌比例。

A cryopreservation solution

【技术实现步骤摘要】
一种低温冻存保存液
本专利技术涉及一种低温冻存保存液，具体涉及一种菌群移植过程中使用的低温冻存保存液。
技术介绍
近年来关于肠道菌群的研究不断涌现，肠道菌群在人类健康中的作用也越来越得到人们关注。人体肠道菌群种类多达1000余种，细菌总数多达100万亿，是宿主细胞数量的10倍。肠道菌群主要分布于结肠。结肠菌数量为1012个/g肠内容物，而回肠菌、空肠菌和十二指肠菌依次为107个/g肠内容物、104个/g肠内容物、103个/g肠内容物。居于远端肠道内的菌群紧贴肠黏膜表面，并与上皮细胞粘连，形成细菌生物膜菌群，从而影响肠道的通透性。同时，还与营养物质的吸收、分布、代谢、排泄以及肠道免疫系统密切相关。随着人们对肠道菌群研究的加深，人体微生态系统与人类健康和疾病的关系得以更加清晰，一方面精神系统、呼吸系统、代谢系统及消化道系统等疾病的发生与发展与肠道菌群紊乱密切相关，另一方面通过干预人体肠道微生态调节紊乱的肠道菌群至平衡状态也能延缓疾病的进程，如菌群移植。菌群移植（FMT）就是将健康人粪便中的功能菌群，移植到患者胃肠道内，重建具有正常功能的肠道菌群，实现肠道及肠道外疾病的治疗。在国际合作组对此词进行统一之前，少数情况下被译为“粪菌移植”、“肠菌治疗”和“肠菌移植”或“肠微生态移植”。2013年菌群移植技术已经被美国食品药品监督管理局批准用于治疗复发性难辨梭状芽孢杆菌感染(Clostridiumdifficileinfection，CDI)的治疗，同年也被美国《时代》杂志评选为“十大医学突破”之一。越来越多的基础科学和临床研究表明，菌群移植技术对治疗炎症性肠病、肠易激综合征、便秘、肥胖及糖尿病等慢性代谢疾病都有其独到的优势。2017年，肝病领域顶级期刊《Hepatology》以封面文章刊登了来自厦门大学附属中山医院团队关于肠菌移植治疗慢性乙型肝炎的重要研究结果。该研究中证实肠菌移植（IMT）对于乙肝e抗原（HBeAg）阳性慢性乙型肝炎的患者有一定的疗效，可以诱导那些进行了长期的抗病毒治疗后仍为HBeAg阳性患者的抗原清除。因此，菌群移植的技术和理念正在被越来越多的人认可。迄今为止,FMT被认为是安全有效的治疗方法,FMT的治疗效果主要依赖于供体选择、移植途径及剂量等，尤其依赖于FMT操作过程中活菌的比例。而在FMT的操作中，菌群分离提取后的保存是一个非常重要的方面，如果菌体保存得当，活菌比例高，那么临床的移植效果会较好，反之不然。无论是单菌还是从健康供体分离出的菌群，当前人们主要是使用保护剂如甘油及二甲基亚砜保存在-80℃的低温条件下以避免细胞内的结合水等物质形成冰晶破坏细胞，而由于菌群移植菌液需进入人体的特殊性及安全性，甘油则作为目前主要的菌群移植用冻存溶剂。甘油又名丙三醇,是一种无色、无臭、味甘的粘稠液体，其具有保水作用，广泛用于菌体的低温保存。在菌群移植过程中，使用甘油来保存菌群，一方面可能会患者头晕、恶心及腹泻等症状；另一方面，去除菌液中的甘油时需要反复离心洗涤，这既使操作步骤变得繁琐又使得菌体因为曝氧及机械损伤等引起活菌比例下降。为了避免以上问题，需要找到可以替代甘油、直接食用的其它冻存保护剂，并确保其能维持较好的菌体保存效果。但目前国内外尚无相应的文章或专利进行介绍，因此本专利以活菌比例及细菌菌群结构的角度比较分析不同冻存保护剂与甘油的情况，从而找到可以替代甘油的低温冻存保护剂方案。
技术实现思路
本专利技术提供了一种低温冻存保存液，以至少解决现有技术中患者在菌群移植过程的不良反应，同时去除菌液中甘油的繁琐操作过程会导致活菌比例下降的问题。本专利技术提供了一种低温冻存保存液，包括重量百分比的组份如下：3-15%的可食用保存物质、85-97%的生理盐水，所述可食用保存物质选自甘油、葡萄糖、蜂蜜、山梨糖醇、蔗糖、脱脂牛奶中的一种或多种。进一步地，所述可食用保存物质由甘油、葡萄糖、蜂蜜、山梨糖醇、蔗糖、脱脂牛奶等体积混合而成。进一步地，所述可食用保存物质为山梨糖醇。更进一步地，所述低温冻存保存液包括7%-12%的山梨糖醇。进一步地，所述生理盐水为0.9%浓度的NaCl水溶液。本专利技术还公开了一种使用上述低温冻存保存液制备的菌群移植物，由下列重量份的原料组成：菌种3.5-5重量份、低温冻存保存液0.7-1.1重量份。进一步地，所述菌种为粪菌。更进一步地，所述粪菌的提取方法如下：取100~200g的供体粪便溶解于750mL~1L的0.9%NaCl溶液中，使用粪便分析前处理仪对其进行处理，去除残渣，获得粪菌30-40g。本专利技术与现有技术相比，采用可食用保存物质与生理盐水替换甘油，避免了患者在菌群移植过程的不良反应。同时，本专利技术的菌群移植物可直接使用于移植过程，避免了去除菌液中甘油的过程，提高活菌的比例。附图说明图1为本专利技术实施例的实验流程图；图2为菌体在冻存不同时间梯度下的活菌比例；图3为菌群在不同冻存保护剂下冻存1周的活菌比例；图4为菌群在不同冻存保护剂下冻存1月的活菌比例；图5为菌群在不同冻存保护剂下冻存3月的活菌比例；图6为菌群在不同冻存保护剂下不同冻存时间下的菌群多样性比较；图7为菌群在不同冻存保护剂下冻存3个月后门水平的菌群组成；图8为菌群在不同冻存保护剂下冻存3个月后科水平的菌群组成。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本专利技术方案，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本专利技术保护的范围。需要说明的是，本专利技术的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。本专利技术实施例中共涉及8种冻存保护液处理，包括甘油组、山梨糖醇组、葡萄糖组、蔗糖组、蜂蜜组、脱脂牛奶组、混合液组（山梨糖醇、葡萄糖、蔗糖、蜂蜜及脱脂牛奶等体积混合）及空白对照组。共涉及7个时间点，即将分体的菌体分别按照8种冻存保护液处理后置于-80℃条件下冻存0天，1周，2周，3周，1月，2月及3月后进行流式细胞活菌计数及16SrDNA测序分析，评估各保护液对细菌的冻存保护效果。其中，甘油组中低温冻存保存液含8%-15%的甘油（本实施例中甘油含量为8%）、山梨糖醇组中低温冻存保存液含7%-12%的山梨糖醇（本实施例中山梨糖醇含量为7%）、葡萄糖组中低温冻存保存液含6%-10%的葡萄糖（本实施例中葡萄糖含量为6%）、蔗糖组中低温冻存保存液含3%-6%的蔗糖（本实施例中蔗糖含量为3%）、蜂蜜组中低温冻存保存液含8-12%的蜂蜜（本实施例中蜂蜜含量为8%）、脱脂牛奶组中低温冻存保存液含8-12%的脱脂牛奶（本实施例中脱脂牛奶含量为8%）、混合液组中低温冻存保存液含8-12%的可食用保存物质（本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种低温冻存保存液，其特征在于，所述低温冻存保存液包括重量百分比的组份如下：3-15%的可食用保存物质、85-97%的生理盐水，所述可食用保存物质选自甘油、葡萄糖、蜂蜜、山梨糖醇、蔗糖、脱脂牛奶中的一种或多种。/n

【技术特征摘要】
1.一种低温冻存保存液，其特征在于，所述低温冻存保存液包括重量百分比的组份如下：3-15%的可食用保存物质、85-97%的生理盐水，所述可食用保存物质选自甘油、葡萄糖、蜂蜜、山梨糖醇、蔗糖、脱脂牛奶中的一种或多种。


2.根据权利要求1所述生物样品冻存保存方法，其特征在于，所述可食用保存物质由甘油、葡萄糖、蜂蜜、山梨糖醇、蔗糖、脱脂牛奶等体积混合而成。


3.根据权利要求1所述生物样品冻存保存方法，其特征在于，所述可食用保存物质为山梨糖醇。


4.根据权利要求3所述生物样品冻存保存方法，其特征在于，所述低温冻存保存液包括7%-12%的山梨糖醇。

【专利技术属性】
技术研发人员：陈章然，肖传兴，许鸿志，任建林，张帮周，杨晓宁，
申请(专利权)人：厦门承葛生物科技有限公司，厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35