一种检测高度片段化样本的变性增强数字微滴PCR方法技术

本发明专利技术公开了一种检测高度片段化样本的变性增强数字微滴PCR方法。本发明专利技术有助于提高痕量高度片段化游离DNA检测灵敏度和特异性。并提供了几组检测游离DNA的寡核苷酸的序列。

A denaturing enhanced digital microdrop PCR method for detecting highly fragmented samples

【技术实现步骤摘要】
一种检测高度片段化样本的变性增强数字微滴PCR方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及检测高度片段化样本的变性增强数字微滴PCR方法。
技术介绍
在痕量临床样本的检验，如ctDNA的液体活检，因其有作为临床重要生物标志物的潜力而备受关注。现阶段精准医学在以下几个方面，面临着艰巨的挑战：1)样品少：2-3ml孕妇外周血只有1个胎儿细胞；1ml全血只有1-100个循环肿瘤细胞；而孕妇及肿瘤患者的外周血中(游离DNA)cfDNA和ctDNA更是少之又少。2)干扰强：肿瘤的异质性以及肿瘤周围大量的正常组织细胞，导致待测目标核酸片段周围存在着数万倍的其它干扰。3)常规PCR反应体系至少需要10个分子，误差在5％以上，而且也难以在3万个野生分子中检测出1个突变分子。4)常规PCR无法分辨2倍以下基因表达差异(或拷贝数差异)，难以鉴定频率低于1％的等位基因。相比于传统PCR(qPCR)技术，数字PCR技术在诸多方面体现出巨大优势，并有望成为未来核酸定量诊断的金标准技术：1)绝对定量，无需标准曲线；2)超高灵敏度，达1/百万；3)高精确度；4)直达单拷贝级最低检出限；5)高耐受性，抗干扰等。科研人员进行生物学研究时，需要从各种类型的样本中提取核酸(DNA，或RNA)。其中，体液样本含有高度片段化的DNA，又称为游离DNA，对该样本中的DNA进行生物学检测是重要的检测步骤。例如血浆DNA，是血液中细胞外的DNA，以核小体(DNA-蛋白质复合体)的形式存在。这类碎片化的DNA长度在几十至几百碱基对(主峰为166bp)。这类碎片化DNA通常由少量凋亡细胞释放至血液循环系统中，含量极低，现有PCR方法很难检测到可靠信息。尽管取得了部分进展，但数字PCR技术仍受到有限的可供分析的DNA拷贝的限制。当仅有纳克级级ctDNA时，获得的信息会受到统计抽样误差的影响，并且可供分析的临床相关靶点的数量会减少。在液体活检中，起始物质缺乏是数字PCR及液体活检的瓶颈，因为无论分析敏感性如何，数字PCR技术的检测限不能超过DNA输入上限。巢式PCR具有富集微量DNA效果，但是巢式PCR易带来非特异扩增，影响检测准确性。短扩增片段PCR由于扩增子片段大小较小，因此引物设计范围较小，难以保证特异性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测高度片段化样本的变性增强数字微滴PCR方法，提高高度片段化游离DNA检测灵敏度，易于标准化，批间差小，相比巢式PCR非特异扩增少，相比短片段PCR特异性强。为解决上述技术问题，本专利技术的提供一种检测高度片段化样本的变性增强数字微滴PCR方法，其包括如下步骤：(1)从样本中提取cfDNA,(2)将提取的cfDNA进行末端修复，末端修复反应条件为：30℃保持10-20分钟；65℃保持10-20分钟；得到末端修复游离DNA；(3)以得到的末端修复游离DNA为模板，使用RaindropdigitalPCRSystem进行微滴生成，然后进行PCR反应，PCR反应程序为：95℃8-10分钟；重复50个循环：94℃20-35秒，56℃1-3分钟；98℃10-15分钟，最.后10℃终止；(4)PCR反应完成后使用RaindropdigitalPCRSystem进行读取实验结果，记录携带对应荧光液滴拷贝数。本专利技术优选的技术方案中，所述样本选自血浆DNA、尿液DNA、汗液DNA、唾液DNA、精液DNA、胸水DNA、腹水DNA、粪便DNA、化石DNA、石蜡包埋DNA。本专利技术优选的技术方案中，步骤(2)中，末端修复反应体系为：游离DNA10ng，末端修复酶2μL，反应缓冲液5μL，加入Tris-HCl(10mM)定容反应体系到50μL。本专利技术优选的技术方案中，步骤(3)中，反应体系为：末端修复游离DNA2μL，2XddPCR反应缓冲液10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，Taqmanprobe-10.5μL，Taqmanprobe-20.5μL，加入水定容反应体系到20μL。本专利技术优选的技术方案中，步骤(4)中，检测荧光的种类包括FAM、HEX、VIC。技术名词：cfDNA是指,循环游离DNA或者细胞游离DNA，释放到血浆中的降解的DNA片段。本专利技术的提供一种检测高度片段化样本的变性增强数字微滴PCR方法，其包括如下步骤：(A)从样本中提取cfDNA,(B)将提取的游离DNA进行单管变性增强数字PCR：将提取的cfDNA10ng，20X末端修复酶0.5μL，2XddPCR反应缓冲液10μL，上下游引物各1μL，Taqman探针-10.5μL，Taqman探针-20.5μL，加入水定容到20μL，使用RaindropdigitalPCRSystem进行微滴生成，然后进行PCR反应，PCR反应程序为：30℃10-20分钟，65℃10-20分钟，重复50个循环：95℃10分钟，94℃30秒，56℃1分钟；98℃10分钟，最.后10℃终止；(C)PCR反应完成后使用RaindropdigitalPCRSystem进行读取实验结果，记录携带对应荧光液滴拷贝数。本专利技术优选的技术方案中，所述样本选自血浆DNA、尿液DNA、汗液DNA、唾液DNA、精液DNA、胸水DNA、腹水DNA、粪便DNA、化石DNA、石蜡包埋DNA。本专利技术优选的技术方案中，步骤(C)中，检测荧光的种类包括FAM、HEX、VIC。本专利技术第三方面提供一组检测游离DNA寡核苷酸，可用于上述检测方法的引物组合物，由序列表SEQIDNo.1至序列表SEQIDNo.4所示碱基序列的寡核苷酸组成；其中SEQIDNo.1和SEQIDNo.2分别为扩增BRAF基因的上、下游引物，SEQIDNo.3和SEQIDNo.4分别为扩增BRAF基因V600E位点的探针。BRAF-15-F2AGACCTCACAGTAAAAATAGGTSEQIDNo.1BRAF-15-R2ACAACTGTTCAAACTGATGGSEQIDNo.2BRAF-WT6FAM-TCTAGCTACAGTGAAATCTCGA-BHQ1aSEQIDNo.3BRAF-V600E-MutHEX-TCTAGCTACAGAGAAATCTCGA-BHQ1SEQIDNo.4本专利技术还提供一组检测游离DNA寡核苷酸，可用于上述检测方法的引物组合物，由序列表SEQIDNo.5至序列表SEQIDNo.7所示碱基序列的寡核苷酸组成；其中SEQIDNo.5和SEQIDNo.6分别为扩增BRAF基因的上、下游引物，SEQIDNo.3和SEQIDNo.7分别为扩增BRAF基因V600K位点的探针。BRAF1–15-F1TTTCTTCATGAAGACCTCACAS本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测高度片段化样本的变性增强数字微滴PCR方法，其包括如下步骤：/n(1)从样本中提取游离DNA,/n(2)将提取的游离DNA进行末端修复，末端修复反应条件为：30℃保持10-20分钟；65℃保持10-20分钟；得到末端修复游离DNA；/n(3)以末端修复游离DNA为模板，使用Raindrop digital PCR System进行微滴生成，然后进行PCR反应，PCR反应程序为：95℃ 10分钟；/n重复50个循环：94℃ 30秒，56℃ 1分钟；/n98℃ 10分钟，最.后10℃终止；/n(4)PCR反应完成后使用Raindrop digital PCR System进行读取实验结果，记录携带对应荧光液滴拷贝数。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测高度片段化样本的变性增强数字微滴PCR方法，其包括如下步骤：
(1)从样本中提取游离DNA,
(2)将提取的游离DNA进行末端修复，末端修复反应条件为：30℃保持10-20分钟；65℃保持10-20分钟；得到末端修复游离DNA；
(3)以末端修复游离DNA为模板，使用RaindropdigitalPCRSystem进行微滴生成，然后进行PCR反应，PCR反应程序为：95℃10分钟；
重复50个循环：94℃30秒，56℃1分钟；
98℃10分钟，最.后10℃终止；
(4)PCR反应完成后使用RaindropdigitalPCRSystem进行读取实验结果，记录携带对应荧光液滴拷贝数。


2.根据权利要求1所述的变性增强数字微滴PCR方法，其特征在于，所述样本选自血浆DNA、尿液DNA、汗液DNA、唾液DNA、精液DNA、胸水DNA、腹水DNA、粪便DNA、化石DNA、石蜡包埋DNA。


3.根据权利要求2所述的变性增强数字微滴PCR方法，其特征在于，步骤(2)中，末端修复反应体系为：游离DNA10ng，末端修复酶2μL，反应缓冲液5μL，加入Tris-HCl,10mM,定容反应体系到50μL。


4.根据权利要求1所述的变性增强数字微滴PCR方法，其特征在于，步骤(4)中，检测荧光的种类包括FAM、HEX、VIC。


5.一种检测高度片段化样本的变性增强数字微滴PCR方法，其包括如下步骤：
(A)从样本中提取游离DNA,
(B)将提取的游离DNA进行单管变性增强数字PCR：将提取的游离DNAX10ng，20X末端修复酶0.5μL，2XddPCR反应缓冲液10μL，上下游引物各1μL，Taqman探针-10.5μL，Taqman探针-20.5μL，加入水定容到20μL，
使用Raindropdigi...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈谦，刘弘扬，刘泓，李新新，贾海雪，
申请(专利权)人：苏州索真生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32