修饰的指导RNA，CRISPR-核糖核蛋白复合物和使用方法技术

本文描述了修饰的指导RNA，例如单指导RNA，其从5'至3'包括单链原间隔序列、Cas9多肽结合区的第一互补链、结合生物素结合分子的适体以及Cas9多肽结合区的第二互补链。还描述了RNP复合物，其包括修饰的指导RNA和Cas9多肽或其活性片段。还包括使用修饰的指导RNA修饰细胞中靶基因的方法。

Modified guide RNA, CRISPR ribonucleoprotein complex and method of use

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】修饰的指导RNA，CRISPR-核糖核蛋白复合物和使用方法联邦基金声明本专利技术是根据国立卫生研究院授予的GM119644和国家科学基金授予的CBET1350178在政府支持下做出的。政府在本专利技术中具有某些权利。
本公开涉及修饰的指导RNA和含经修饰的指导RNA的CRISPR-核糖核蛋白复合物以及它们在基因组编辑方法中的用途。
技术介绍
人类基因组中DNA序列的精确编辑可用于纠正突变或引入新的遗传功能，用于许多生物医学目的。具体地，目前正在开发预制CRISPR核糖核蛋白(RNPs)的非病毒形式的递送，以用于体细胞基因编辑应用。例如，结合产脓链球菌(Streptococcuspyogenes)Cas9核酸酶(Sp.Cas9，一种从II型CRISPR相关系统分离的高亲和力核酸酶)和单指导RNA(sgRNA)的RNP，产生靶标(on-target)DNA双链断裂(DSB)，同时几乎没有非靶标(off-target)DNA裂解。可以通过易于出错的非同源末端接合(NHEJ)或精确同源定向修复(HDR)(其中使用模板)来修复此断裂。核酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种修饰的指导RNA，其包含/ncrRNA，所述crRNA包含单链原间隔序列和Cas9多肽的结合区的第一互补链，和/ntracrRNA，所述tracrRNA包含Cas9多肽的结合区的第二互补链，/n其中所述crRNA或tracrRNA包含结合生物素结合分子的适体，/n其中所述crRNA和tracrRNA通过所述Cas9多肽的结合区的第一互补链和第二互补链杂交。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170614 US 62/519,3171.一种修饰的指导RNA，其包含
crRNA，所述crRNA包含单链原间隔序列和Cas9多肽的结合区的第一互补链，和
tracrRNA，所述tracrRNA包含Cas9多肽的结合区的第二互补链，
其中所述crRNA或tracrRNA包含结合生物素结合分子的适体，
其中所述crRNA和tracrRNA通过所述Cas9多肽的结合区的第一互补链和第二互补链杂交。


2.根据权利要求1所述的修饰的指导RNA，其中所述crRNA和tracrRNA形成sgRNA，所述sgRNA从5’至3’包含，
单链原间隔序列，
Cas9多肽的结合区的第一互补链，
结合生物素结合分子的适体，和
Cas9多肽的结合区的第二互补链。


3.根据权利要求2所述的修饰的指导RNA，其中在修饰的sgRNA的二级结构中，Cas9多肽的结合区和结合生物素结合分子的适体形成茎-环结构。


4.根据权利要求3所述的修饰的指导RNA，其具有序列
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NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCCGAAUACGAGAUGCGGCCGCCGACCAGAAUCAUGCAAGUGCGUAAGAUAGUCGCGGGUCGGCGGCCGCAUCUCGUAUUCGUUUU(SEQIDNO：3)；或
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5.一种RNP复合物，其包含权利要求1-4中任一项或多项所述的修饰的指导RNA和Cas9多肽或其活性片段。


6.根据权利要求5所述的RNP复合物，其进一步包含生物素结合分子。


7.根据权利要求6所述的RNP复合物，其中所述生物素结合分子具有一个、两个或四个生物素结合位点，其中所述生物素结合分子任选地包含荧光标记。


8.根据权利要求6和7中任一项或多项的RNP复合物，其进一步包含生物素化分子。


9.根据权利要求8所述的RNP复合物，其中所述生物素化分子是生物素化的供体多核苷酸。


10.根据权利要求9所述的RNP复合物，其中所述供体多核苷酸包含单链DNA、双链DNA、RNA或RNA和DNA的双链体。


11.根据权利要求9或权利要求10所述的RNP复合物，其中所述供体多核苷酸包括突变、缺失、改变、整合、基因校正、基...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾里德·马修·卡尔森斯蒂弗默，克莉莎努·萨哈，阿姆·阿什拉夫·阿卜丁，露西尔·凯瑟琳·科伦伯格，
申请(专利权)人：威斯康星校友研究基金会，
类型：发明
国别省市：美国;US