一种宿主米曲霉敲除系统及其构建方法与应用技术方案

本发明专利技术涉及一种宿主米曲霉表达系统及其构建方法与应用。所述宿主米曲霉表达系统的构建方法，步骤如下：(i)将重组质粒pBluescript‑hph‑rfp的多克隆位点上通过酶切连接的方法构建上敲除同源臂；(ii)将活化后的曲霉菌丝加入到细胞壁裂解酶溶液中，制得感受态原生质体；然后加入含有敲除同源臂的重组质粒，制得转化原生质体；(iii)将转化原生质体进行筛选培养，选取转化子，制得宿主米曲霉表达系统。本发明专利技术首次将RFP红色荧光蛋白应用到米曲霉基因敲除的过程当中，可以快速有效的排除掉大量假阳性的转化子。

A host Aspergillus oryzae knockout system and its construction and Application

【技术实现步骤摘要】
一种宿主米曲霉敲除系统及其构建方法与应用
本专利技术涉及一种宿主米曲霉表达系统及其构建方法与应用，特别涉及利用多种破壁酶降解真菌的细胞壁，用具有潮霉素抗性和RFP红色荧光蛋白的双重筛选质粒作为介导，通过原生质体转化的方法，构建的米曲霉基因敲除体系，属于分子生物学

技术介绍
米曲霉因其强大的胞外蛋白分泌能力，被广泛的应用于工业和食品产业中。米曲霉生长速度较快，初期呈现黄色或者黄绿色菌落，随着菌株生长后期变为黄褐色，能产生大量的分生孢子。米曲霉有着丰富的酶系，可产生蛋白酶、淀粉酶和果胶酶等等。由于其高效的蛋白分泌能力，优良菌株的选育和研究已经成为米曲霉研究的重要内容。伴随着科学技术的发展，通过基因组工程技术，进行遗传改造的方法在米曲霉上也得到了广泛应用，相比于传统的化学诱变、物理诱变和原生质体融合等方法，目的性更强效率更高。现有的专利中大多使用农杆菌介导的方式进行转化，相对来讲操作步骤较多，操作相对复杂，农杆菌的培养时间较长，增加实验时间。改进现有的转化方法，以期获得更简便的操作，节省转化的时间和工作量是研究的重要内容。制备原生质体进行转化是丝状真菌中使用到的转化方法，例如CN105463009A和CN103865948A等专利中，都提到了在不同的丝状真菌中原生质体的制备方法。丝状真菌的细胞壁成分主要为几丁质、葡聚糖和甘露聚糖。对于不同的真菌，其细胞壁的成分及比例存在较大的差异。因此，针对不同的菌株要制定相对应的细胞壁酶解方案，以提高原生质体的制备效率和质量。在米曲霉的基因改造中，常用的转化筛选方法包括营养缺陷型标记、抗性基因标记筛选法。米曲霉的营养缺陷型难以获得且操作复杂，因此限制了这一选择性标记的应用范围。药物抗性基因转入后，可使菌株在一定浓度的药物下生长，作为显性筛选标记应用相对广泛。常使用的抗生素有潮霉素，博来霉素，腐草霉素和黄安尿素等。因此使用药物抗性基因是米曲霉转化中经常使用的筛选方法。但米曲霉对多种药物具有抗性，能使用的抗性标记种类较少，在利用抗性基因筛选过程中常常观察到假阳性现象(抗生素未能完全抑制生长的非转化子)，影响阳性转化子的挑取和筛选，增加实验中的工作量。1999年红色荧光蛋白首次被报道，与绿色荧光蛋白相比，红色荧光蛋白的激发和发射波长更长可以覆盖绿色荧光蛋白所不能涉及的波长段，更为重要的是红色荧光蛋白在细胞中成像观察时背景更低，更适用于生物学研究。因此将红色荧光蛋白应用到米曲霉的转化体系中具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种宿主米曲霉敲除系统及其构建方法与应用，其以潮霉素抗性和RFP荧光蛋白的双重筛选质粒作为介导，并通过原生质体制备的方式进行转化解决现有系统中存在的转化操作复杂和假阳性过高的问题。本专利技术所解决的技术问题采用以下方案来实现：一种重组质粒pBluescript-hph-rfp，采用如下方法制备：(1)以pCSR1::hph质粒为模板，进行PCR扩增，获得潮霉素抗性基因片段；所述PCR扩增的特异引物，核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所述：HPH-F：ATAAGCTTGATATCGAATTCGGAGGTCAACACATCAATGC；SEQIDNO.1HPH-R：ACGTCCTCGGAGGAGGCCATCTCTATTCCTTTGCCCTCGG；SEQIDNO.2(2)以质粒pDB790，进行PCR扩增，获得红色荧光蛋白表达基因片段；所述PCR扩增的特异引物，核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所述：RFP-F：CCGAGGGCAAAGGAATAGAGATGGCCTCCTCCGAGGACGT；SEQIDNO.3RFP-R：GCTCTAGAACTAGTGGATCCTTAGGCGCCGGTGGAGTGGC；SEQIDNO.4(3)以步骤(1)制得的潮霉素抗性基因片段(HPH)和步骤(2)制得的红色荧光蛋表达基因片段(RFP)为模板，采用核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.4所述的引物经overlapPCR扩增，制得HPH+RFP表达元件；(4)将载体pBluescript和步骤(3)制得的HPH+RFP表达元件经限制性内切酶EcoRΙ和BamHΙ双酶切，然后进行连接，制得重组质粒pBluescript-hph-rfp。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增体系如下：PCR扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸5min。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增体系如下：PCR扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸5min。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中，overlapPCR扩增体系如下：OverlapPCR扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，32个循环；72℃延伸5min。根据本专利技术优选的，所述步骤(4)中，连接条件为T4连接酶16℃条件下连接3h。一种宿主米曲霉表达系统，含有上述重组质粒pBluescript-hph-rfp。上述宿主米曲霉表达系统的构建方法，步骤如下：(i)将重组质粒pBluescript-hph-rfp的多克隆位点上通过酶切连接的方法构建上敲除同源臂；(ii)将活化后的曲霉菌丝加入到细胞壁裂解酶溶液中，在30℃下酶解2.5小时，过滤并离心，STC溶液悬浮，制得感受态原生质体；然后加入步骤(i)制得的含有敲除同源臂的重组质粒，在质量百分比60％的PEG4000溶液环境中，室温放置25min，制得转化原生质体；所述细胞壁裂解酶溶液组份如下，均为质量百分比：1％纤维素酶(cellulase)、1％裂解酶(lysing)、0.15％蜗牛酶(Snailase)、余量为浓度0.7M的NaCl水溶液；(iii)将步骤(ii)制得的转化原生质体在26～29℃、含有潮霉素的完全培养基中进行筛选培养70～75h，选取转化子，基因验证，制得宿主米曲霉表达系统。根据本专利技术优选的，所述步骤(ii)中，STC溶液组份如下：山梨醇0.8M、Tris-HCl50mM、CaCl250mM，pH8.0。根据本专利技术优选的，所述步骤(iii)中，潮霉素的浓度为600mg/ml。根据本专利技术优选的，所述步骤(iii)中，完全培养基每升组份如下：氮盐溶液50ml、葡萄糖10g、蛋白胨2g/L、酵母提取物1g/L、水解酪蛋白1g/L、琼脂粉15g/L；所述氮盐溶液每升组份如下：NaNO3120g、KCl10.4g、MgSO4·7H2O10.4g、KH2PO430.4g。上述宿主米曲霉表达系统本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组质粒pBluescript-hph-rfp，其特征在于，采用如下方法制备：/n(1)以pCSR1::hph质粒为模板，进行PCR扩增，获得潮霉素抗性基因片段；/n所述PCR扩增的特异引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述：/n(2)以pDB790，进行PCR扩增，获得红色荧光蛋白表达基因片段；/n所述PCR扩增的特异引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所述：/n(3)以步骤(1)制得的潮霉素抗性基因片段和步骤(2)制得的红色荧光蛋表达基因片段为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所述的引物经overlap PCR扩增，制得HPH+RFP表达元件；/n(4)将载体pBluescript和步骤(3)制得的HPH+RFP表达元件经限制性内切酶EcoRΙ和BamHΙ双酶切，然后进行连接，制得重组质粒pBluescript-hph-rfp。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组质粒pBluescript-hph-rfp，其特征在于，采用如下方法制备：
(1)以pCSR1::hph质粒为模板，进行PCR扩增，获得潮霉素抗性基因片段；
所述PCR扩增的特异引物，核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所述：
(2)以pDB790，进行PCR扩增，获得红色荧光蛋白表达基因片段；
所述PCR扩增的特异引物，核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所述：
(3)以步骤(1)制得的潮霉素抗性基因片段和步骤(2)制得的红色荧光蛋表达基因片段为模板，采用核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.4所述的引物经overlapPCR扩增，制得HPH+RFP表达元件；
(4)将载体pBluescript和步骤(3)制得的HPH+RFP表达元件经限制性内切酶EcoRΙ和BamHΙ双酶切，然后进行连接，制得重组质粒pBluescript-hph-rfp。


2.如权利要求1所述的重组质粒pBluescript-hph-rfp，其特征在于，所述步骤(1)中，PCR扩增体系如下：



PCR扩增程序如下：
94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸5min。


3.如权利要求1所述的重组质粒pBluescript-hph-rfp，其特征在于，所述步骤(2)中，
PCR扩增体系如下：



PCR扩增程序如下：
94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸5min。


4.如权利要求1所述的重组质粒pBluescript-hph-rfp，其特征在于，所述步骤(3)中，
overlapPCR扩增体系如下：



OverlapPCR扩增程序如下：
94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，32个循环；72℃延伸5min。


5.如权利要求1所述的重组质粒pBluescript-hph-rfp，其特征在于，所述步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：王婧臻，郑红云，楚杰，王莹，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，山东省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37