一种基于胶原的天然高分子水凝胶及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种基于胶原的天然高分子水凝胶及其制备方法，属于水凝胶领域。本发明专利技术首先合成了一种糖原衍生物用作交联剂氧化胍基糖原，该糖原衍生物表面有多种基团，能够通过化学键与静电作用将无机成分羟基磷灰石和有机成分胶原连接起来，可以将天然高分子材料与无机材料进行更合的结合和联用，从而形成能够有效定向诱导MSCs分化的水凝胶。本发明专利技术制备得到的基于胶原的天然高分子水凝胶料具有一定的拉伸性、弹性以及可弯折能力，压缩模量与弹性模量处于能够使骨髓间充质干细胞分化成软骨、成骨的区间范围内，在面对较大的骨损伤时，可以保证不易被破坏。

Natural macromolecule hydrogel based on collagen and preparation method thereof

【技术实现步骤摘要】
一种基于胶原的天然高分子水凝胶及其制备方法
本专利技术涉及一种基于胶原的天然高分子水凝胶及其制备方法，属于水凝胶领域。
技术介绍
现代社会的人们生活节奏快，习惯于快速行走，从而易导致骨骼以及软骨损伤的发生。因为骨组织中缺乏淋巴、血管以及神经分布，在修复过程中缺乏营养供给，仅靠基质、关节腔滑液的有限营养以及成骨与软骨细胞微弱的自身分裂能力，使得骨组织无法进行有效的自我修复。软骨损伤后会引起膝关节疼痛、关节失稳、关节僵硬等临床症状，严重时会发生继发骨性关节炎，这也是是引起肢体功能障碍及残疾的重要原因，会严重影响患者生活质量。故软骨损伤的修复问题是现代医疗的一个重点关注问题。现有的骨损伤治疗方法主要分成两种，即手术法和组织工程法。手术方法虽具有一定疗效，但对患者的膝关节功能改善作用有限，且手术过程复杂，操作难度大，患者还需忍受手术带来的疼痛。组织工程法可以通过模仿细胞外环境的关键部分来改变干细胞的分化情况，其中，间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是多能细胞，其可在体外和体内产生间充质和非间充质组织，并且拥有出色的分化能力，可分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。此外，还可以通过调节生物材料的物理性质来调节干细胞的分化，生物材料的物理性质包括成分、机械性能、2D形貌和3D空间等因素，尤其是2D表面上的化学功能的特定性质诸如刚度、表面的电荷和亲水性等因素已被证明对干细胞的分化有重要影响。细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)衍生的蛋白质和/或肽，例如I型胶原蛋白，被引入到基质上，用于选择性指导神经发生、肌生成和成骨。除有机分子外，无机元素也可用于指导细胞分化，例如，现有技术发现将羟基磷灰石相添加到材料中有更好的细胞和蛋白质粘附性，增强了细胞增殖以及更高的成骨基因的表达。在软骨及成骨修复方面，国内及国际上已有一些生物支架、海绵的相关研究。生物支架与海绵可以用作填充物，同时引导干细胞在其上黏附生长。相比支架和海绵这类固体支架，水凝胶材料拥有更易亲水的三维网络结构，在水中可以快速溶胀并保持大量体积的水而不溶解。水凝胶的此特性使其在组织工程的应用方面具有很高的价值，水凝胶在植入生物体后，其自身与生物流体和组织之间的接触面趋于模糊，能够降低表面张力、减少细胞和蛋白在表面的吸附、降低其与周围的摩擦并减小对周围组织的破坏，从而避免炎症发生。目前，现有技术公开过将胶原和羟基磷灰石相结合制备得到软骨材料的报道，但是现有技术主要将二者进行简单的物理混合，这种技术无法将羟基磷灰石与胶原进行交联，在后续使用过程中，由于密度以及在体内的存在形式不同，会导致二者极易分离，在体内应用时会存在一定的风险，因此需要寻找一种克服二者无法长期共存的水凝胶体系。
技术实现思路
【技术问题】现有技术的水凝胶存在无机组分在其中分布不均匀、无法长期稳定存在的问题。【技术方案】为了解决上述问题，本专利技术首先合成了一种糖原衍生物用作交联剂，该糖原衍生物表面有多种基团，能够通过化学键与静电作用将无机成分羟基磷灰石和有机成分胶原连接起来，可以将天然高分子材料与无机材料进行更合的结合和联用，从而形成能够有效定向诱导MSCs分化的水凝胶。首先，本专利技术提供了一种氧化胍基糖原，所述氧化胍基糖原的结构式为：其中，m≥1，n≥1，i≥1，平均分子量为8000～1000kDa。其次，本专利技术提供了上述氧化胍基糖原的制备方法，包括以下步骤：(1)糖原的正电化：将糖原溶于二甲基亚砜中形成质量体积比为0.5-2％(单位为g/mL，下同)的溶液，之后加入1-20倍于糖原的物质的量的N,N-羰基二咪唑，惰性气氛保护下搅拌1一小时，之后将5-50倍于糖原的物质的量的乙二胺溶于5mL二甲基亚砜得到乙二胺溶液，并将乙二胺溶液滴加至上述活化后的反应溶液中，惰性气氛保护下反应12-24小时，纯化、干燥后得到氨基化糖原；(2)在氨基化糖原上接枝胍基：将胍基乙酸溶于水中得到质量体积比为0.5-2％的胍基乙酸溶液并调节pH为5-6，向胍基乙酸溶液中加入1-5倍于胍基乙酸的物质的量的1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和1-5倍于胍基乙酸的物质的量的N-羟基琥珀酰亚胺，活化0.5-4小时后加入0.1-1倍于胍基乙酸的物质的量的步骤(1)制备得到的氨基化糖原并调节溶液pH为7-8，反应12-16小时，纯化、干燥后得到胍基糖原；(3)胍基糖原的氧化：将适量的步骤(2)制备得到的胍基糖原溶于水中得到质量体积比为0.5-2％的胍基糖原溶液，再加入1-5倍于胍基糖原的物质的量的高碘酸钠，遮光反应1-3小时，纯化、干燥后得到氧化胍基糖原。在本专利技术的一种实施方式中，所述纯化为将产物在3500Da、7000Da或14000Da透析袋中透析24-72h。在本专利技术的一种实施方式中，所述干燥优选为冷冻干燥。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)中所述调节pH的方法是用盐酸或氢氧化钠调节，所述盐酸或氢氧化钠的浓度优选为1mol/L。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)中，反应结束时，加入2-10倍于胍基糖原的物质的量的乙二醇终止反应。在本专利技术的一种实施方式中，所述惰性气氛为氮气、氦气、氩气等气氛。第三，本专利技术提供了一种基于胶原的天然高分子水凝胶的制备方法，所述方法包括：分别配制得到浓度为11.25-22.5mg/mL的胶原水溶液以及浓度为37.5-75mg/mL的氧化胍基糖原溶液，再在氧化胍基糖原溶液中按照每1mL溶液中添加0-25mg纳米羟基磷灰石，得到掺杂纳米羟基磷灰石的氧化胍基糖原溶液；将胶原水溶液和掺杂纳米羟基磷灰石的氧化胍基糖原溶液按照体积比2:1混合，之后15-60分钟之后将碳酸盐缓冲液滴加在混合溶液上，静置2-24h，从模具中取出后用质量体积分数为0.05％的硼氢化钠溶液还原0.5-2h，水洗后灭菌(如紫外灭菌)即可得到基于胶原的天然高分子水凝胶。在本专利技术的一种实施方式中，所述水洗的次数为1-6次；所述杀菌为紫外灯下照射0.5-4h。在本专利技术的一种实施方式中，所述碳酸盐缓冲液为碳酸钠-碳酸氢钠溶液，浓度为0.5-2mol/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述水优选为超纯水。第四，本专利技术提供了上述制备方法制备得到的基于胶原的天然高分子水凝胶。第五，本专利技术提供了包含上述基于胶原的天然高分子水凝胶的保健品或药物。第六，本专利技术提供了上述基于胶原的天然高分子水凝胶在MSCs分化中的应用。本专利技术取得的有益技术效果为：(1)本专利技术制备得到的基于胶原的天然高分子水凝胶中，胶原之间通过氧化胍基糖原进行交联，同时氧化胍基糖原将纳米羟基磷灰石均匀分散在其中，最终形成了淡黄色的固态凝胶，具有一定的拉伸性、弹性以及可弯折能力，压缩模量与弹性模量处于能够使骨髓间充质干细胞分化成软骨、成骨的区间范围内(软骨分化压缩模量～80kPa，成骨分化压缩模量～190kPa；骨分化弹性模量：40～80kPa)。对成本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种氧化胍基糖原，其特征在于，所述氧化胍基糖原的结构式为：/n

【技术特征摘要】
1.一种氧化胍基糖原，其特征在于，所述氧化胍基糖原的结构式为：



其中，m≥1，n≥1，i≥1，平均分子量为8000～1000kDa。


2.权利要求1所述的氧化胍基糖原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)糖原的正电化：将糖原溶于二甲基亚砜中形成质量体积比为0.5-2％的溶液，之后加入1-20倍于糖原的物质的量的N,N-羰基二咪唑，惰性气氛保护下搅拌0.5-4小时，之后将5-50倍于糖原的物质的量的乙二胺溶于二甲基亚砜得到乙二胺溶液，并将乙二胺溶液滴加至上述活化后的反应溶液中，惰性气氛保护下反应12-24小时，纯化、干燥后得到氨基化糖原；
(2)在氨基化糖原上接枝胍基：将胍基乙酸溶于水中得到质量体积比为0.5-2％的胍基乙酸溶液并调节pH为5-6，向胍基乙酸溶液中加入1-5倍于胍基乙酸的物质的量的碳二亚胺盐酸盐和1-5倍于胍基乙酸的物质的量的N-羟基琥珀酰亚胺，活化0.5-4小时后加入0.1-1倍于胍基乙酸的物质的量的步骤(1)制备得到的氨基化糖原并调节溶液pH为7-8，反应12-16小时，纯化、干燥后得到胍基糖原；
(3)胍基糖原的氧化：将适量的步骤(2)制备得到的胍基糖原溶于水中得到质量体积比为0.5-2％的胍基糖原溶液，再加入1-5倍于胍基糖原的物质的量的高碘酸钠，避光反应1-3小时，纯化、干燥后得到氧化胍基糖原。


3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，反应结束时，加入2-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈敬华，任伟业，张羲和，周娟，程咏梅，陆金婷，
申请(专利权)人：无锡贝迪生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32