一种从食用菌中分离纯化脑苷脂B的方法技术

本发明专利技术公开了一种从食用菌中分离纯化脑苷脂B的方法，属于分离纯化技术领域，包括：S1，将食用菌原料烘干然后粉碎过筛，得到干食用菌粉。S2，向所述干食用菌粉中加入提取液，然后静置过滤，提取到脑苷脂B粗品；S3，将所述脑苷脂B粗品用烷烃类溶剂复溶，进行离心处理，将处理后得到的上清取出；S4，使用正相固相萃取柱对所述上清进行纯化，待固相萃取柱上样后，依次使用烷烃类溶剂、所述醚类溶剂、酮类溶剂洗脱；S5，将所述洗脱液使用反相半制备型高效液相，设定纯化参数，按照液相方法进一步纯化所述洗脱液，最终得到纯度为99％以上的脑苷脂B。本发明专利技术建立了一种从食用菌中分离纯化脑苷脂B的方法，处理方法简单、重现性好。

A method of separation and purification of cerebroside B from edible fungi

【技术实现步骤摘要】
一种从食用菌中分离纯化脑苷脂B的方法
本专利技术属于分离纯化
，涉及一种从食用菌中分离纯化脑苷脂B的方法。
技术介绍
脑苷脂由单糖、酰胺连接脂肪酸和类鞘脂碱组成的一种物质，其广泛存在于植物、动物大脑、肌肉和食用菌中，具有较强的生理活性，其中一些具有抗动脉硬化、抗神经变性和抗动脉粥样硬化的作用。目前，脑苷脂的研究主要集中在海参等海洋生物中，成本较高，这大大限制了相关研究进展。而食用菌的价格低很多，以香菇为例，是原产于中国的一种食用菌，年产量130万吨。它是中国重要的出口商品之一，也是世界第二大类食用菌，富含多种氨基酸、矿物质元素及功能性成分，对人体有较高的生理活性。因此，食用菌也可成为低成本制取脑苷脂的原料，促进科研、医药等相关领域的发展。
技术实现思路
有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术针对上述现有技术上的不足，提供一种从食用菌中分离纯化脑苷脂B的方法，本专利技术处理方法简单、重现性好，适合于科研和医药等相关行业。为实现上述目的，本专利技术公开了一种从食用菌中分离纯化脑苷脂B的方法，包括如下制备步骤：S1，将食用菌原料烘干至含水量低于10％，烘干温度为50-70℃，然后粉碎过200目筛，得到干食用菌粉。S2，按液料比向所述干食用菌粉中加入含有醚类溶剂和醇类溶剂的提取液，磁力搅拌后进行提取操作，然后静置过滤，提取到脑苷脂B粗品；S3，将所述脑苷脂B粗品减压蒸馏蒸干后用烷烃类溶剂复溶，进行离心处理，离心转数为4000-12000r/min，时长为15min，将处理后得到的上清取出；S4，使用正相固相萃取柱对所述上清进行纯化，待固相萃取柱上样后，依次使用烷烃类溶剂、所述醚类溶剂、酮类溶剂洗脱，其中脑苷脂B富集于酮类溶剂洗脱液，纯度为20％-60％；S5，将所述洗脱液减压蒸馏蒸干后用甲醇复溶，使用反相半制备型高效液相，设定纯化参数，按照液相方法进一步纯化所述洗脱液，最终得到纯度为99％以上的脑苷脂B，纯化使用的流动相为A、B、C。进一步地，所述提取操作的提取温度为50℃-70℃，提取时长为10-20h。进一步地，所述提取液的醚类溶剂与醇类溶剂的体积比为1～5：1，所述液料比为1:5～20。进一步地，所述食用菌原料为香菇、猴头菇、金针菇、杏鲍菇的一种。进一步地，所述醚类溶剂为乙醚、丙醚、正丁醚、叔丁基甲醚或叔丁基乙醚的一种，所述醇类溶剂为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇或叔丁醇的一种，所述烷烃类溶剂为正戊烷、异戊烷、正己烷、3-甲基戊烷或2，3-二甲基丁烷的一种，所述酮类溶剂为丙酮、丁酮、或甲基异戊酮的一种。进一步地，所述正相固相萃取柱为Si-SPE、NH2-SPE或CN-SPE的一种。进一步地，所述反相半制备型高效液相的色谱柱填料为C-18、C-30或NH2的一种。进一步地，所述纯化参数：流速为2～5ml/min，柱温为35～55℃，检测波长为210nm。进一步地，所述流动相A为体积比为1:2～6的醚类溶剂、醇类溶剂与0.1％甲酸混合的混合液，所述流动相B为乙腈，所述流动相C为水。进一步地，所述液相方法为：从开始到第3分钟，使用35％的所述流动相B和20％的所述流动相C；从第3分钟到第10分钟，使用35％-50％的所述流动相B和20％-5％的所述流动相C；从第10分钟到第15分钟，使用50％-55％的所述流动相B和5％-0％的所述流动相C；从第15分钟到第35分钟，使用55％的所述流动相B和0％所述流动相C。本专利技术的有益效果是，与现有技术相比，本专利技术建立了一种从食用菌中分离纯化脑苷脂B的方法，最终样品纯度高于99％，处理方法简单、重现性好。本专利技术在医药、科研及相关领域中有良好的应用前景。以下将结合附图对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。提供这些说明的目的仅在于帮助解释本专利技术，不应当用来限制本专利技术的权利要求的范围。附图说明图1为本专利技术较佳实施例从食用菌中分离纯化脑苷脂B的方法的流程图；图2为最终制得高纯脑苷脂样品HPLC色谱图；图3为实施例所得脑苷脂B样品色谱图；图4为对比例所得脑苷脂B样品色谱图。具体实施方式下面结合附图以及具体实施例进一步详细描述本专利技术。应理解，实施方式只是为了举例说明本专利技术，而非以任何形式限制专利技术的范围。本专利技术可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本专利技术的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。实施例：将新鲜香菇洗净，烘干磨粉、过筛。使用叔丁基甲醚/甲醇(1：1)的混合液，55℃提取20小时后，减压蒸馏除去溶剂，并使用异戊烷复溶。使用经异戊烷活化的Si-SPE纯化样品，上样完毕后，依次使用3柱体积的异戊烷、叔丁基甲醚、丁酮洗脱。脑苷脂B富集于丁酮洗脱组份，HPLC分析图如图1所示，脑苷脂B于22.3分钟处，纯度为51.2％。高效液相半制备：将丁酮洗脱组份减压蒸馏，去除溶剂并使用甲醇复溶。流动相分别为A(叔丁基甲醚/甲醇，1:6，0.1％甲酸)、B(乙腈)和C(水)，流速为4ml/min，柱温35℃，检测波长210nm，液相方法为：0-3.0分钟,35％的B和20％的C；3.0-10.0分钟，35％-50％的B和20％-5％的C；10.0-15.0分钟，50％-55％的B和5％-0％的C；15.0-35.0分钟55％的B和0％的C。收集相应的22分钟峰处的样品，如图2所示，即得到高纯度脑苷脂B。对比例：从食用菌中提取脑苷脂，将菌丝体置于60℃烘箱中4天，待菌丝体完全干燥后用粉碎机粉碎至粉末状样品，取1000克该样品于2升的圆底烧瓶中并加入少量碎瓷片，加入氯仿/甲醇1L(85：15)，圆底烧瓶上端连接回流提取器，提取器上端连接冷凝水回流。加热至沸腾保持2小时后为结束第一次，共回流提取三次。将经过过滤后的提取液减压蒸馏，去除溶剂待用。使用正相硅胶柱(15mmx460mm)纯化样品，氯仿/甲醇(85：15)作为洗脱液，流速1ml/min；每2ml洗脱液作为一个馏分进行收集。使用正向硅胶薄层检视各馏分，氯仿/甲醇(85：15)作为展开剂。合并Rf值0.3的馏分，合并后的馏分减压蒸馏并以氯仿重结晶，得到脑苷脂B(22.3分钟)样品，如图3所示。上述对比例，使用薄层色谱检测、正相硅胶柱纯化脑苷脂样品，耗时耗力，重现性差，检测精度低，不能明确脑苷脂洗脱组份与时间。使用固相萃取小柱纯化，HPLC检测并制备脑苷脂B，精度高，重现性强，且最终半制备得到样品纯度可达99％以上。以上详细描述了本专利技术的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本专利技术的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本
中技术人员依本专利技术的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从食用菌中分离纯化脑苷脂B的方法，其特征在于，包括如下制备步骤：/nS1，将食用菌原料烘干至含水量低于10％，烘干温度为50-70℃，然后粉碎过200目筛，得到干食用菌粉。/nS2，按液料比向所述干食用菌粉中加入含有醚类溶剂和醇类溶剂的提取液，磁力搅拌后进行提取操作，然后静置过滤，提取到脑苷脂B粗品；/nS3，将所述脑苷脂B粗品减压蒸馏蒸干后用烷烃类溶剂复溶，进行离心处理，离心转数为4000-12000r/min，时长为15min，将处理后得到的上清取出；/nS4，使用正相固相萃取柱对所述上清进行纯化，待固相萃取柱上样后，依次使用烷烃类溶剂、所述醚类溶剂、酮类溶剂洗脱，其中脑苷脂B富集于酮类溶剂洗脱液，纯度为20％-60％；/nS5，将所述洗脱液减压蒸馏蒸干后用甲醇复溶，使用反相半制备型高效液相，设定纯化参数，按照液相方法进一步纯化所述洗脱液，最终得到纯度为99％以上的脑苷脂B，纯化使用的流动相为A、B、C。/n

【技术特征摘要】
1.一种从食用菌中分离纯化脑苷脂B的方法，其特征在于，包括如下制备步骤：
S1，将食用菌原料烘干至含水量低于10％，烘干温度为50-70℃，然后粉碎过200目筛，得到干食用菌粉。
S2，按液料比向所述干食用菌粉中加入含有醚类溶剂和醇类溶剂的提取液，磁力搅拌后进行提取操作，然后静置过滤，提取到脑苷脂B粗品；
S3，将所述脑苷脂B粗品减压蒸馏蒸干后用烷烃类溶剂复溶，进行离心处理，离心转数为4000-12000r/min，时长为15min，将处理后得到的上清取出；
S4，使用正相固相萃取柱对所述上清进行纯化，待固相萃取柱上样后，依次使用烷烃类溶剂、所述醚类溶剂、酮类溶剂洗脱，其中脑苷脂B富集于酮类溶剂洗脱液，纯度为20％-60％；
S5，将所述洗脱液减压蒸馏蒸干后用甲醇复溶，使用反相半制备型高效液相，设定纯化参数，按照液相方法进一步纯化所述洗脱液，最终得到纯度为99％以上的脑苷脂B，纯化使用的流动相为A、B、C。


2.如权利要求1所述的从食用菌中分离纯化脑苷脂B的方法，其特征在于，所述提取操作的提取温度为50℃-70℃，提取时长为10-20h。


3.如权利要求1所述的从食用菌中分离纯化脑苷脂B的方法，其特征在于，所述提取液的醚类溶剂与醇类溶剂的体积比为1～5：1，所述液料比为1:5～20。


4.如权利要求1所述的从食用菌中分离纯化脑苷脂B的方法，其特征在于，所述食用菌原料为香菇、猴头菇、金针菇、杏鲍菇的一种。


5.如权利要求1所述的从食用菌中分离纯化脑苷脂B的...

【专利技术属性】
技术研发人员：敬璞，温心遥，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31