光固化酶交联型生物墨水及其制备方法和3D打印方法技术

本发明专利技术公开一种光固化酶交联型生物墨水及其制备方法和3D打印方法。该光固化酶交联型生物墨水中，纤维蛋白原的质量百分数为0.1～50wt％，甲基丙烯酸酐化明胶的质量百分数为0.1～50wt％，光引发剂的质量百分数为0.01～20wt％。本发明专利技术的光固化酶交联型生物墨水具有材料组分多样化，在甲基丙烯酸化明胶的紫外光交联基础上，增加纤维蛋白原的酶交联，构建含有生物活性细胞的双网络型水凝胶体系。应用该光固化酶交联型生物墨水打印而成的生物仿生结构具有高细胞相容性、高力学强度、高可降解性和无细胞毒性的特点，为生物活性细胞的增殖、分化和迁延提供良好的仿生环境，可应用于生物组织构建和修复等组织工程领域。

UV curable enzyme crosslinked bio ink and its preparation method and 3D printing method

【技术实现步骤摘要】
光固化酶交联型生物墨水及其制备方法和3D打印方法
本专利技术涉及生物3D打印
，特别是涉及一种光固化酶交联型生物墨水及其制备方法和3D打印方法。
技术介绍
生物3D打印技术作为生物仿生结构制备方法之一，具有精确控制生物仿生结构形态和细胞分布的优点。生物3D打印技术能够在三维空间中精确控制打印结构，可以根据人体独特的解剖和生理标准打印出复杂的仿生结构，为组织工程和临床修复组织或器官缺损的医疗领域提供了全新的技术手段。现有的生物3D打印墨水组分单一，通常只包含一种水凝胶体系。交联方式亦较为单一，通常只采用化学交联，物理交联或者酶交联等方式的其中一种。这类生物墨水打印而成生物3D仿生结构呈单网络水凝胶体系，通常只具备一种特性，例如，由纤维蛋白原构成的水凝胶体系，虽然其具有优异的生物细胞相容性和细胞粘附性，但是其力学性能远不如由甲基丙烯酸化明胶构成的水凝胶体系。组分单一的生物3D打印墨水打印而成的生物3D仿生结构难以同时兼顾细胞相容性、力学强度和可降解性的要求。因此，针对现有技术不足，提供一种光固化酶交联型生物墨水及其制备方法和3D打印方法以克服现有技术不足甚为必要。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种光固化酶交联型生物墨水及其制备方法以解决现有技术中生物3D打印墨水组分单一，交联方式单一，打印成型的3D仿生结构难以同时兼顾细胞相容性、力学强度和可降解性的要求的问题。为了实现上述专利技术的目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种光固化酶交联型生物墨水的制备方法，包括如下步骤：S1，预先制备纤维蛋白原液和甲基丙烯酸酐化明胶液；纤维蛋白原液的制备过程是将无菌纤维蛋白原粉末与1×～10×的细胞培养基溶液混合，于0℃～40℃条件下振荡溶解得到纤维蛋白原液，所得到的纤维蛋白原液在-80℃～37℃保存待用；甲基丙烯酸酐化明胶液的制备是将甲基丙烯酸酐化明胶和光引发剂粉末共混，光引发剂与甲基丙烯酸酐化明胶的重量比为0.01～50:1，再加入1×～10×的细胞培养基溶液，在0℃～80℃、避光的条件下搅拌0.5～6h得到甲基丙烯酸酐化明胶液，所得到的甲基丙烯酸酐化明胶液避光在-80℃～37℃保存待用；S2，将预先制备的纤维蛋白原液和甲基丙烯酸酐化明胶液按照体积比1:1至1:10的比例混合均匀得到生物墨水材料本体，按照1×105～5×107个/mL的量将生物活性细胞混入生物墨水材料本体中，余量为1×～10×的细胞培养基溶液，制备得到光固化酶交联型生物墨水；优选的，上述光固化酶交联型生物墨水中，纤维蛋白原的质量百分数为0.1～50wt％，甲基丙烯酸酐化明胶的质量百分数为0.1～50wt％，光引发剂的质量百分数为0.01～20wt％。优选的，上述光引发剂为2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮或苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂。优选的，上述光固化酶交联型生物墨水中，纤维蛋白原的质量百分数为1～10wt％，甲基丙烯酸酐化明胶的质量百分数为0.1～15wt％，光引发剂的质量百分数为0.1～1wt％。优选的，上述光固化酶交联型生物墨水中，纤维蛋白原的质量百分数为1～5wt％，甲基丙烯酸酐化明胶的质量百分数为2.5～7.5wt％，光引发剂的质量百分数为0.1～0.2wt％。优选的，上述光固化酶交联型生物墨水中，纤维蛋白原的质量百分数为5wt％，甲基丙烯酸酐化明胶的质量百分数为5wt％，光引发剂的质量百分数为0.2wt％。本专利技术的第二个目的是提供一种光固化酶交联型生物墨水。该生物墨水通过上述方法制备得到，具有材料组分多样化，在甲基丙烯酸化明胶的紫外光交联基础上，增加纤维蛋白原的酶交联，构建含有生物活性细胞的双网络型水凝胶体系。应用该光固化酶交联型生物墨水打印而成的生物仿生结构具有高细胞相容性、高力学强度、高可降解性和无细胞毒性的特点，为生物活性细胞的增殖、分化和迁延提供良好的仿生环境。本专利技术的第三个目的是提供一种应用光固化酶交联型生物墨水进行生物仿生结构的3D打印方法，包括如下步骤：(1)将光固化酶交联型生物墨水装载入3D打印机的打印料仓内，设置料仓温度为0℃至45℃、喷头移动速度为0～100mm/s、挤出压力为0～25MPa、打印平台温度为0℃至45℃；(2)根据所需数字模型进行打印，打印的同时进行紫外灯照射，并对打印结构进行光交联；所采用的紫外光的波长为500～315nm，光照强度为5～500mw/cm2，照射时间为1～90s；(3)在打印结构表面加入交联溶液，使得交联溶液完全浸没打印结构，放入孵箱培养10min至2h；(4)将打印结构转移至完全培养基内，放置细胞培养箱内进行培养。优选的，上述步骤(3)，在打印过程中，在每一层打印结构表面加入酶交联溶液，使得酶交联溶液均匀分布于打印结构中。优选的，上述酶交联溶液由如下组分构成：当量浓度为0.1～400mM氯化钙溶液、当量浓度为1～100U/mL凝血酶溶液、余量为1×～10×的细胞培养基溶液。优选的，上述酶交联溶液通过如下步骤制备：将当量浓度为100～400mM氯化钙溶液、当量浓度为1～100U/mL凝血酶溶液、余量为1×～10×的细胞培养基溶液共混，混合均匀后放置于-80℃～40℃保存。本专利技术相对于现有技术的有益效果是：(1)本专利技术以纤维蛋白原和甲基丙烯酸酐化明胶为主要固相生物材料，以细胞培养基为液相材料，制备出一种交联方式多样化的生物墨水。(2)本专利技术中纤维蛋白原在酶交联作用下形成的水凝胶体系具有高细胞粘附力，高细胞相容性的优点。甲基丙烯酸酐化明胶在光引发剂和紫外光照射作用下迅速进行化学交联形成的水凝胶，具有高力学强度高可降解性和无细胞毒性的优点。(3)本专利技术的生物3D打印方法，打印结构在打印甲基丙烯酸化明胶的紫外光交联水凝胶的基础上，逐层增加纤维蛋白原的酶交联水凝胶，形成均匀、紧密分布的双网络型水凝胶体系。最终打印成型的仿生结构同时具有两种水凝胶体系的优点，即高细胞相容性、高力学强度、高可降解性和无细胞毒性，为生物活性细胞的增殖、分化和迁延提供良好的仿生环境，为组织工程和临床修复组织或器官缺损的医疗领域提供了全新的技术手段。附图说明利用附图对本专利技术作进一步的说明，但附图中的内容不构成对本专利技术的任何限制。图1是应用本专利技术的光固化酶交联型生物墨水进行生物仿生结构3D打印的过程示意图。图2是生物活性细胞在本专利技术实施例5的光固化酶交联型生物墨水打印结构中培养2天后的活死染色实验结果图(二维与三维图)，生物活性细胞的生长情况良好。图3是生物活性细胞在本专利技术实施例5的光固化酶交联型生物墨水打印结构中培养7天后，进行F-actin染色实验结果图(二维与三维图)，生物活性细胞的生长情况良好。具体实施方式结合以下实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术具体实施方式是通过制备和应用两方面进行实施的。实施例1一种光固化酶交联型本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种光固化酶交联型生物墨水的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1，预先制备纤维蛋白原液和甲基丙烯酸酐化明胶液；/n纤维蛋白原液的制备过程是将无菌纤维蛋白原粉末与1×～10×的细胞培养基溶液混合，于0℃～40℃条件下振荡溶解得到纤维蛋白原液，所得到的纤维蛋白原液在-80℃～37℃保存待用；/n甲基丙烯酸酐化明胶液的制备是将甲基丙烯酸酐化明胶和光引发剂粉末共混，光引发剂与甲基丙烯酸酐化明胶的重量比为0.01～50:1，再加入1×～10×的细胞培养基溶液，在0℃～80℃、避光的条件下搅拌0.5～6h得到甲基丙烯酸酐化明胶液，所得到的甲基丙烯酸酐化明胶液避光在-80℃～37℃保存待用；/nS2，将预先制备的纤维蛋白原液和甲基丙烯酸酐化明胶液按照体积比1:1至1:10的比例混合均匀得到生物墨水材料本体，按照1×10

【技术特征摘要】
1.一种光固化酶交联型生物墨水的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，预先制备纤维蛋白原液和甲基丙烯酸酐化明胶液；
纤维蛋白原液的制备过程是将无菌纤维蛋白原粉末与1×～10×的细胞培养基溶液混合，于0℃～40℃条件下振荡溶解得到纤维蛋白原液，所得到的纤维蛋白原液在-80℃～37℃保存待用；
甲基丙烯酸酐化明胶液的制备是将甲基丙烯酸酐化明胶和光引发剂粉末共混，光引发剂与甲基丙烯酸酐化明胶的重量比为0.01～50:1，再加入1×～10×的细胞培养基溶液，在0℃～80℃、避光的条件下搅拌0.5～6h得到甲基丙烯酸酐化明胶液，所得到的甲基丙烯酸酐化明胶液避光在-80℃～37℃保存待用；
S2，将预先制备的纤维蛋白原液和甲基丙烯酸酐化明胶液按照体积比1:1至1:10的比例混合均匀得到生物墨水材料本体，按照1×105～5×107个/mL的量将生物活性细胞混入生物墨水材料本体中，余量为1×～10×的细胞培养基溶液，制备得到光固化酶交联型生物墨水；
在光固化酶交联型生物墨水中，纤维蛋白原的质量百分数为0.1～50wt％，甲基丙烯酸酐化明胶的质量百分数为0.1～50wt％，光引发剂的质量百分数为0.01～20wt％。


2.根据权利要求1所述的光固化酶交联型生物墨水的制备方法，其特征在于，所述光引发剂为2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮或苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂。


3.根据权利要求1或2所述的光固化酶交联型生物墨水的制备方法，其特征在于，所述光固化酶交联型生物墨水中，纤维蛋白原的质量百分数为1～10wt％，甲基丙烯酸酐化明胶的质量百分数为0.1～15wt％，光引发剂的质量百分数为0.1～1wt％。


4.根据权利要求3所述的光固化酶交联型生物墨水的制备方法，其特征在于，所述光固化酶交联型生物墨水中，纤维蛋白原的质量百分数为1～5wt％，甲基丙烯酸酐化明胶的质量百分数为2.5～7.5wt％，光引发剂的质量百分数为0.1～0...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄文华，吴耀彬，李婷，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44