一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织制造技术

本发明专利技术公开了一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织，其制备方法包括以下步骤：配制骨支架仿生生物墨水、骨膜仿生生物墨水、肌纤维膜仿生生物墨水、肌肉仿生生物墨水；将MSCs和C2C12分别与对应的仿生生物墨水混合；使用多通道挤出3D生物打印机打印成型仿生骨、仿生骨膜、仿生肌纤维膜、仿生肌肉四层复合组织工程支架。本发明专利技术一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织，能够使创伤性骨骼肌损伤恢复时纤维化最小；通过多通道挤出3D生物打印制备的仿生骨骼肌复合组织，可以同时替代骨和骨骼肌的结构和功能，支持成肌细胞和成骨细胞的增殖和分化；并且利用3D生物打印技术使植入物易于定制，从而适应任何缺损形状。

Preparation of biomimetic skeletal muscle composite tissue by multi-channel extrusion 3D bioprinting

【技术实现步骤摘要】
一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织
本专利技术涉及生物材料
，特别涉及一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织。
技术介绍
骨骼肌是人体最大和最重要的器官之一，占体重的45％(Choi,J.S.etal.JournalofControlledRelease.2016,222:107-115)。其中每两个人中就有一个人以上受到骨骼肌损伤的影响。机动车事故、挤压伤和爆炸造成的严重创伤性肌肉损伤都是造成严重残疾的原因，并且会导致严重的疼和痛漫长的恢复期，加重病人的经济负担(Yelin,E.,etal.SeminarsinArthritisandRheumatism.46(3):259-260)。肌肉功能依赖于稳定的骨头上适当的插入点，所以骨和肌肉都受损的创伤愈合的特别差。虽然最近在骨—肌肉组织工程方面取得了进展，但是目前还没有临床可用的有效的骨—肌肉植入物。这主要是由于设计和构建由具有不同物理化学性质的多种类型组织组成的三维(3D)构建体具有一定的复杂性。治疗骨骼肌损伤的一个关键的临床挑战是骨骼肌损伤主要通过结疤而不是肌肉再生来愈合。这种纤维性疤痕组织是不柔韧的，没有功能的，并且限制了肌肉力量的恢复(Lemos,D.R.etal.NatureMedicine2015,21:786-794)。我们可以通过开发有效的骨—肌肉植入物以支持功能性肌肉组织的再生来克服纤维化。但是目前还没有一种有效的植入材料可以同时替代骨和骨骼肌的结构和功能，从而使这些区域的细胞都能正常生长。另外，骨骼肌损伤没有确定的形状或尺寸，这使得不可能提前设计植入物。目前，重建骨—肌肉组织的方法大多数依赖于自体移植物的移植。然而自体移植物受到骨头的数量的限制，并且在重建手术期间可能会引起提供骨头部位发生病变。虽然涉及骨和肌肉的皮瓣可以转移，但这块肌肉没有功能，不能与支撑肌肉组织相结合。因此，本专利技术提出一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织，能够同时支持功能性骨骼肌和骨组织再生的新型骨—肌肉组织植入物，这种用于治疗骨骼和肌肉严重损伤的有效骨—肌肉植入物是重建仿生的、连续的骨骼/肌肉结构，在创伤性骨骼肌损伤恢复时，使纤维化最小化，能够支持成肌细胞和成骨细胞的增殖和分化，易于定制以适应任何缺损形状。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织，可以有效解决
技术介绍
中的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织的制备方法，该方法包括以下步骤：S1、通过向明胶水溶液中滴加甲基丙烯酸酐(MA)，得到高MA取代度和低MA取代度的甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)溶液，GelMA溶液包括仿生骨、仿生骨膜、仿生肌纤维膜、仿生肌肉四种，将甲基丙烯酸酯化明胶溶在低温下冷冻干燥，制得冻干GelMA；S2、将步骤S1中不同浓度的冻干GelMA、藻酸盐(SA)和明胶溶解于去离子水中，得到不同比例的GelMA预聚物溶液；S3、使用探针型超声波均质器将羟基磷灰石(HAP)和白磷钙石(WH)纳米粒子在去离子水中超声处理，然后将不同浓度的HAP和WH纳米粒子水溶液与步骤S2中对应的GelMA预聚物溶液充分混合，得到GelMA复合溶液；S4、在步骤S3制得的GelMA复合溶液中加入一定浓度的2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮(PI)，得到对应的仿生生物墨水，仿生生物墨水包括骨支架仿生生物墨水、骨膜仿生生物墨水、肌纤维膜仿生生物墨水、肌肉仿生生物墨水；S5、在打印之前，将所有溶液储存在恒温箱中；将成骨细胞(MSCs)与骨支架仿生生物墨水混合，MSCs和骨骼肌成肌细胞(C2C12)与骨膜仿生生物墨水混合，MSCs和C2C12与肌纤维膜仿生生物墨水混合，并将C2C12与肌肉仿生生物墨水混合，实现细胞在水凝胶中的均匀分散；S6、使用多通道挤出3D生物打印机依据G代码命令，按一定挤出压力和速度完成细胞负载仿生生物墨水在三维立体方向上的成型及骨骼肌组织图案化，最终获得仿生骨、仿生骨膜、仿生肌纤维膜、仿生肌肉四层复合组织工程支架；S7、生物打印后，立即将制备的样品暴露于UV照射下以实现光交联，然后用聚丁二酸丁二醇(PBS)洗涤并置于培养箱内的细胞培养基中。优选的，所述步骤S1中，GelMA溶液中MA的取代度范围为：仿生骨为60.0-90.0％，仿生骨膜为10.0-30.0％，仿生肌纤维膜为10.0-30.0％，仿生肌肉为10.0-30.0％。优选的，所述步骤S2具体操作为：仿生骨中GelMA的浓度为5.0-10.0％(W/V)，SA的浓度为0.0-3.0％(W/V)，明胶的浓度为2.0-5.0％(W/V)；仿生骨膜中GelMA的浓度为2.0-7.0％(W/V)，SA的浓度为0.0-3.0％(W/V)，明胶的浓度为1.0-4.0％(W/V)；仿生肌纤维膜中GelMA的浓度为2.0-7.0％(W/V)，SA的浓度为0.0-3.0％(W/V)，明胶的浓度为1.0-4.0％(W/V)；仿生肌肉中GelMA的浓度为2.0-7.0％(W/V)，SA的浓度为0.0-3.0％(W/V)，明胶的浓度为2.0-5.0％(W/V)；将上述四层物质对应的溶液分别溶解于70-90℃的去离子水中，加热0.5-3h。优选的，所述步骤S3中的HAP和WH纳米粒子的超声处理时间为10-50min，HAP和WH纳米粒子水溶液的浓度为：仿生骨中HAP和WH纳米粒子水溶液的浓度范围为50.0-200.0μg·mL-1，HAP纳米粒子水溶液和WH纳米粒子水溶液的体积比为5:1、4:1、3:1、1:1四种中的一种；仿生骨膜中HAP和WH纳米粒子水溶液的浓度范围为5.0-30.0μg·mL-1，HAP纳米粒子水溶液和WH纳米粒子水溶液的体积比为4:1、3:1、2:1、1:1四种中的一种；仿生肌纤维膜中HAP和WH纳米粒子水溶液的浓度范围为0.5-20.0μg·mL-1，HAP纳米粒子水溶液和WH纳米粒子水溶液的体积比为4:1、3:1、2:1、1:1四种中的一种；仿生肌肉中HAP和WH纳米粒子水溶液的浓度范围为0.0-10.0μg·mL-1，HAP纳米粒子水溶液和WH纳米粒子水溶液的体积比为3:1、2:1、1:1、0:0四种中的一种。优选的，所述步骤S4中，仿生生物墨水中PI的浓度范围均为0.1-2.0％(W/V)。优选的，所述步骤S5中，恒温箱的温度范围为15-60℃。优选的，所述步骤S5中MSCs和C2C12的浓度范围分别为：仿生骨中MSCs的浓度范围为1.0-5.0M·mL-1；仿生骨膜中MSCs的浓度范围为0.5-4.0M·mL-1，C2C12的浓度范围为0.5-4.0M·mL-1；仿生肌纤维膜中MSCs的浓度范围为0.5-4.0M·mL-1，C2C12的浓度范围为0.5-4.0M·mL-1；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：/nS1、通过向明胶水溶液中滴加甲基丙烯酸酐(MA)，得到高MA取代度和低MA取代度的甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)溶液，GelMA溶液包括仿生骨、仿生骨膜、仿生肌纤维膜、仿生肌肉四种，将甲基丙烯酸酯化明胶溶在低温下冷冻干燥，制得冻干GelMA；/nS2、将步骤S1中不同浓度的冻干GelMA、藻酸盐(SA)和明胶溶解于去离子水中，得到不同比例的GelMA预聚物溶液；/nS3、使用探针型超声波均质器将羟基磷灰石(HAP)和白磷钙石(WH)纳米粒子在去离子水中超声处理，然后将不同浓度的HAP和WH纳米粒子水溶液与步骤S2中对应的GelMA预聚物溶液充分混合，得到GelMA复合溶液；/nS4、在步骤S3制得的GelMA复合溶液中加入一定浓度的2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮(PI)，得到对应的仿生生物墨水，仿生生物墨水包括骨支架仿生生物墨水、骨膜仿生生物墨水、肌纤维膜仿生生物墨水、肌肉仿生生物墨水；/nS5、在打印之前，将所有溶液储存在恒温箱中；将成骨细胞(MSCs)与骨支架仿生生物墨水混合，MSCs和骨骼肌成肌细胞(C2C12)与骨膜仿生生物墨水混合，MSCs和C2C12与肌纤维膜仿生生物墨水混合，并将C2C12与肌肉仿生生物墨水混合，实现细胞在水凝胶中的均匀分散；/nS6、使用多通道挤出3D生物打印机依据G代码命令，按一定挤出压力和速度完成细胞负载仿生生物墨水在三维立体方向上的成型及骨骼肌组织图案化，最终获得仿生骨、仿生骨膜、仿生肌纤维膜、仿生肌肉四层复合组织工程支架；/nS7、生物打印后，立即将制备的样品暴露于UV照射下以实现光交联，然后用聚丁二酸丁二醇(PBS)洗涤并置于培养箱内的细胞培养基中。/n...

【技术特征摘要】
1.一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1、通过向明胶水溶液中滴加甲基丙烯酸酐(MA)，得到高MA取代度和低MA取代度的甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)溶液，GelMA溶液包括仿生骨、仿生骨膜、仿生肌纤维膜、仿生肌肉四种，将甲基丙烯酸酯化明胶溶在低温下冷冻干燥，制得冻干GelMA；
S2、将步骤S1中不同浓度的冻干GelMA、藻酸盐(SA)和明胶溶解于去离子水中，得到不同比例的GelMA预聚物溶液；
S3、使用探针型超声波均质器将羟基磷灰石(HAP)和白磷钙石(WH)纳米粒子在去离子水中超声处理，然后将不同浓度的HAP和WH纳米粒子水溶液与步骤S2中对应的GelMA预聚物溶液充分混合，得到GelMA复合溶液；
S4、在步骤S3制得的GelMA复合溶液中加入一定浓度的2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮(PI)，得到对应的仿生生物墨水，仿生生物墨水包括骨支架仿生生物墨水、骨膜仿生生物墨水、肌纤维膜仿生生物墨水、肌肉仿生生物墨水；
S5、在打印之前，将所有溶液储存在恒温箱中；将成骨细胞(MSCs)与骨支架仿生生物墨水混合，MSCs和骨骼肌成肌细胞(C2C12)与骨膜仿生生物墨水混合，MSCs和C2C12与肌纤维膜仿生生物墨水混合，并将C2C12与肌肉仿生生物墨水混合，实现细胞在水凝胶中的均匀分散；
S6、使用多通道挤出3D生物打印机依据G代码命令，按一定挤出压力和速度完成细胞负载仿生生物墨水在三维立体方向上的成型及骨骼肌组织图案化，最终获得仿生骨、仿生骨膜、仿生肌纤维膜、仿生肌肉四层复合组织工程支架；
S7、生物打印后，立即将制备的样品暴露于UV照射下以实现光交联，然后用聚丁二酸丁二醇(PBS)洗涤并置于培养箱内的细胞培养基中。


2.根据权利要求1所述的一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，GelMA溶液中MA的取代度范围为：仿生骨为60.0-90.0％，仿生骨膜为10.0-30.0％，仿生肌纤维膜为10.0-30.0％，仿生肌肉为10.0-30.0％。


3.根据权利要求1所述的一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织的制备方法，其特征在于，所述步骤S2具体操作为：
仿生骨中GelMA的浓度为5.0-10.0％(W/V)，SA的浓度为0.0-3.0％(W/V)，明胶的浓度为2.0-5.0％(W/V)；
仿生骨膜中GelMA的浓度为2.0-7.0％(W/V)，SA的浓度为0.0-3.0％(W/V)，明胶的浓度为1.0-4.0％(W/V)；
仿生肌纤维膜中GelMA的浓度为2.0-7.0％(W/V)，SA的浓度为0.0-3.0％(W/V)，明胶的浓度为1.0-4.0％(W/V)；
仿生肌肉中GelMA的浓度为2.0-7.0％(W/V)，SA的浓度为0.0-3.0％(W/V)，明胶的浓度为2.0-5.0％...

【专利技术属性】
技术研发人员：张进，黄恒，童冬梅，刘晓晨，李飞翰，
申请(专利权)人：福建省安悦莱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35