一种可限制激活CRISPR/Cas13a的双锁纳米粒子的制备方法和应用技术

一种可限制激活CRISPR/Cas13a的双锁纳米粒子的制备方法和应用，这种纳米颗粒(DLNP)只能在肿瘤组织中限制CRISPR/Cas13a的激活，以进行有效的癌症免疫治疗。DLNP设计为核‑壳结构，其中CRISPR/Cas13a封装在核内，被一层双响应聚合物网络覆盖。在聚乙二醇外壳的保护作用下，DLNP表现出血液循环稳定性。在低pH和高H

Preparation and application of a kind of double lock nanoparticles with limited activation CRISPR / cas13a

【技术实现步骤摘要】
一种可限制激活CRISPR/Cas13a的双锁纳米粒子的制备方法和应用
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种可限制激活CRISPR/Cas13a的双锁纳米粒子的制备方法和应用。
技术介绍
癌症的特征是多种遗传改变或突变所引起的异常代谢和增殖。肿瘤细胞在药物代谢过程的基因突变或药物靶点的修复可引起细胞对传统疗法的耐受。最近，一种新型的簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关酶(Cas)，Cas13a(以前称为C2c2)被鉴定为RNA导向的靶向RNA的CRISPR效应子。Cas13a/CRISPRRNA(crRNA)复合物在靶标目的RNA后同样会激活一般的RNase活性，导致细胞RNA的非特异性裂解，并最终导致程序性细胞死亡或休眠(即“附带效应”)。这种独特的“附带效应”自动绕过了实体瘤对传统疗法的复杂耐药性和逃逸机制，从而使CRISPR/Cas13a系统成为癌症治疗的理想治疗剂，具有降低有效剂量和最小化的耐药性的潜能。但是，这种“附带效应”并不是专门针对肿瘤细胞的，因为一旦任何细胞的RNA达到与Cas13a/crRNA复合物的互补结合，它就可以被激活。当全身施用基于CRISPR/Cas13a系统的药物时，可能会导致与肿瘤以外的组织中不希望的细胞死亡有关的安全性问题。因此，仅在肿瘤细胞中限制CRISPR/Cas13a系统激活的可行策略对于基于CRISPR/Cas13a的药物在癌症治疗中的安全应用至关重要。为了实现对体内CRISPR/Cas13a激活的精确控制，将基于CRISPR/Cas13a的试剂特异地递送到肿瘤组织中至关重要。肿瘤微环境(TME)，特别是酸性微环境(pHe)，是实体瘤的典型特征。基于这一特征，已经成功开发了几种pH响应性非病毒载体(包括无机纳米颗粒和聚合物)来递送CRISPR系统。但是，某些酸性细胞器或其他外部酸性刺激也可能触发CRISPR/Cas13a激活，从而导致潜在的安全问题和严重的副作用。因此，需要更加精确控制的CRISPR/Cas13a激活策略，该策略不通过对酸性微环境单一性响应来实现对CRISPR/Cas13a系统的释放。过表达的活性氧(ROS)，特别是过氧化氢(H2O2)是肿瘤的另一个特征，它不仅在肿瘤的发生中起着独特的作用，而且还影响细胞DNA突变和肿瘤的进展。pHe和H2O2的结合可以有效地区分肿瘤组织和正常组织。因此，响应pHe和H2O2浓度释放有效载荷的载体在CRISPR/Cas13a系统的递送中应该是理想的，这将为CRISPR/Cas13a的激活提供空前的控制。
技术实现思路
本专利技术目的是解决CRISPR/Cas13a系统临床应用过程中所伴随的严重毒副作用的问题，提供一种可限制激活CRISPR/Cas13a系统的双锁纳米粒子(DLNP)的制备方法和应用。DLNP具有核-壳结构，其中CRISPR/Cas13a系统封装在核内，并具有一层双响应聚合物网络。在血液循环或正常组织中，此类聚合物层可赋予DLNP带负电荷的聚乙二醇化表面，从而有效维持其循环稳定性，并通过抑制DLNP的细胞吸收来阻止CRISPR/Cas13a活化。到达肿瘤微环境后，聚合物层将降解为阳离子聚合物，从而促进CRISPR/Cas13a系统的细胞内在化和基因编辑的激活。类似于只能同时打开两个锁的双锁保险箱，DLNP只能在同时存在低pH值和高H2O2浓度的微环境中释放CRISPR/Cas13a系统。DLNP的这种独特特征可以改善CRISPR/Cas13a系统的积累，并增强其在肿瘤部位的基因编辑效率。此外，它还可以通过避免正常组织的意外激活来帮助降低基于CRISPR/Cas13a的癌症治疗的副作用。在这项研究中，选择了在免疫逃逸中起着至关重要作用的PD-L1作为靶点。在CRISPR/Cas13a激活的精准控制下，DLNP成功地积聚到肿瘤中并诱导了PD-L1阳性肿瘤细胞的死亡，并通过对免疫抑制性肿瘤微环境(TME)进行调控而引起了T细胞介导的抗肿瘤免疫的有效激活。本专利技术的技术方案：一种可限制激活CRISPR/Cas13a系统的双锁纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：1)PEI1.8k-HPBA/pDNA的合成，以40的N/P比将编码CRISPR/Cas13a系统的质粒DNA(pDNA)与4-(羟甲基)苯基硼酸(HPBA)修饰的聚乙烯亚胺(PEI1.8k-HPBA)混合以形成多聚体PEI1.8k-HPBA/pDNA。2)双锁纳米粒子DLNP的制备，将步骤1)合成的PEI1.8k-HPBA/pDNA与顺式乌头酸酐(CA)和葡庚糖酸钠脱水物(SGD)改性的聚(乙二醇)-b-聚赖氨酸(mPEG113-b-Plys/SGD/CA)按质量比1:10混合，获得双锁纳米粒子DLNP。进一步的，步骤1)PEI1.8k-HPBA/pDNA的具体合成方法是：首先将4-(羟甲基)苯基硼酸频哪醇酯与羰二咪唑(CDI)以摩尔比1:1.9溶解在超干二氯甲烷(DCM)中室温反应1h。随后将反应混合物用乙酸乙酯稀释，并用去离子水洗涤；有机相经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到CDI活化的频哪醇硼酸酯；然后将PEI1.8k溶解于超干DCM中的溶液中，依次加入CDI活化的频哪醇硼酸酯和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，并在室温下搅拌2h；在室温下，用0.05N的盐酸溶液透析48小时，冻干得PEI1.8k-HPBA；然后将PEI1.8k-HPBA溶解于10mM磷酸盐缓冲液中(PBS)配置1mg/ml的溶液，以40的N/P比将编码CRISPR/Cas13a系统的质粒DNA(pDNA)与PEI1.8k-HPBA混合以形成多聚体PEI1.8k-HPBA/pDNA。进一步的，步骤2)双锁纳米粒子DLNP的具体制备方法是：首先将苄氧羰基-L-赖氨酸与三光气于四氢呋喃(THF)中在60℃下搅拌反应2h以制备苄氧羰基-L-赖氨酸酐Lys(Z)-NCA。随后将Lys(Z)-NCA与甲氧基封端，分子量为5000，末端为伯氨的聚乙二醇(mPEG113-NH2)以摩尔比1:150，溶解于N,N二甲基甲酰胺中。将反应混合物在35℃干燥氩气气氛下搅拌3天，然后在减压下蒸发溶剂，将得到的产物溶解在15ml的三氯甲烷中，然后沉淀到过量的冰乙醚中以获得mPEG-b-PLys(Z)；通过向mPEG-b-PLys(Z)溶液中添加氢溴酸将mPEG-b-PLys(Z)中的Z基团脱保护；用冷乙醚沉淀后，将产物重新溶解在DMF中，并通过0.22μm的Millipore过滤器过滤而纯化；将滤液在过量的乙醚中沉淀，以除去残留的CF3COOH，得到mPEG113-b-PLys，收率60％；然后将产物在室温下真空干燥；接下来用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)于4℃下对葡萄糖庚酸钠(SGD)进行活化，2h后将活化的SGD添加到上述制备的mPEG113-b-PLys溶液中并于4℃反应8h，然后用蒸馏水渗析并冷冻干燥，冻干获得mPEG113-b-PL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可限制激活CRISPR/Cas13a的双锁纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：/n1)PEI

【技术特征摘要】
1.一种可限制激活CRISPR/Cas13a的双锁纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
1)PEI1.8k-HPBA/pDNA的合成，
以40的N/P比将编码CRISPR/Cas13a系统的质粒DNA(pDNA)与4-(羟甲基)苯基硼酸(HPBA)修饰的聚乙烯亚胺(PEI1.8k-HPBA)混合以形成多聚体PEI1.8k-HPBA/pDNA；
2)双锁纳米粒子DLNP的制备，
将步骤1)合成的PEI1.8k-HPBA/pDNA与顺式乌头酸酐(CA)和葡庚糖酸钠脱水物(SGD)改性的聚(乙二醇)-b-聚赖氨酸(mPEG113-b-Plys/SGD/CA)按质量比1:10混合，获得双锁纳米粒子DLNP。


2.根据权利要求1所述的可限制激活CRISPR/Cas13a系统的双锁纳米粒子的制备方法，其特征是步骤1)所述PEI1.8k-HPBA/pDNA的具体合成步骤如下：
首先将4-(羟甲基)苯基硼酸频哪醇酯与羰二咪唑(CDI)以摩尔比1:1.9溶解在超干二氯甲烷(DCM)中室温反应1h；随后将反应混合物用乙酸乙酯稀释，并用去离子水洗涤；有机相经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到CDI活化的频哪醇硼酸酯；然后将PEI1.8k溶解于超干DCM中的溶液中，依次加入CDI活化的频哪醇硼酸酯和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，并在室温下搅拌2h；在室温下，用0.05N的盐酸溶液透析48小时，冻干得PEI1.8k-HPBA；
然后将PEI1.8k-HPBA溶解于10mM磷酸盐缓冲液中(PBS)配置1mg/ml的溶液，以40的N/P比将编码CRISPR/Cas13a系统的质粒DNA(pDNA)与PEI1.8k-HPBA混合以形成多聚体PEI1.8k-HPBA/pDNA。


3.根据权利要求1所述的可限制激活CRISPR/Cas13a系统的双锁纳米粒子的制备方法，其特征是步骤2)所述双锁纳米粒子DLNP的具体制备方法是：
首先将苄氧羰基-L-赖氨酸与三光气于四氢呋喃(THF)中在60℃下搅拌反应2h以制备苄氧羰基-L-赖氨酸酐Lys(Z)-NCA。随后将Lys(Z)-NCA与甲氧基封端，分子量为5000，末端为伯...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈红云，康春生，张展展，刘阳，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津;12