琼胶酶及其制备方法技术

本发明专利技术属于药物化学、生物化工领域，涉及一种交替假单胞菌、一种琼胶酶及制备方法。具体地，本发明专利技术涉及一种来源于潮间带污泥的交替假单胞菌Q30F（Pseudoalteromonas sp.Q30F），该菌株具有营养条件简单、易培养的特点。本发明专利技术还公开了琼胶酶，氨基酸序列及其基因编码。本发明专利技术还涉及上述琼胶酶的编码基因及其表达载体、细胞系。

Agarase and its preparation

【技术实现步骤摘要】
琼胶酶及其制备方法
本专利技术属于药物化学、生物化工领域。
技术介绍
琼胶(Agar)主要产自江蓠、紫菜等食用红藻，与褐藻胶、卡拉胶并称产量最大、用途最广的三大海洋多糖，广泛应用于食品、医药和化工行业。琼脂糖(Agarose)是琼胶的主要成分之一，属中性多糖，其分子主链由二糖单元β-D-半乳糖和3，6-内醚-α-L-半乳糖以α-1，3和β-1，4糖苷键交替连接组成。琼胶寡糖是琼胶水解后得到的分子量较低的寡糖。琼胶寡糖有两类，琼寡糖和新琼寡糖。琼胶寡糖具有抗炎、抗过敏、抗肿瘤、免疫调节、美白、预防糖尿病、抵御植物病害等活性，在食品生产中可作天然防腐剂和甜味剂，在医药领域可作为抗肿瘤、抗过敏、消炎药研发的原料，在化工领域可作为美白、保湿、抗衰老成分用于化妆品的生产。目前，已有琼胶寡糖作为活性成分的保健品和日化产品在日本市场上销售。琼胶寡糖的制备主要有物理降解、化学降解法和酶降解法。国内外有关琼胶寡糖结构和活性方面的报道很少。已有报道的降解方法主要有超声波法．过氧化氢氧化法和酸水解。通过这些传统工艺降解琼胶或琼脂糖后，其寡糖产物的聚合度较为多样，迄今无法有效实现琼胶寡糖的定向制备。相比而言。酶解法在海藻寡糖的制备方法中具有绝对优势。（1）反应过程中产生的副产物少，降解得到的产物专一性强，产物结构受到的损伤小；（2）反应条件温巧，过程易控制。（3）安全环保，对工厂设备损伤小。虽然琼胶酶制备寡糖具有很多优势，但在工业上并没有得到广泛应用，其中高效的、低成本的琼胶酶制剂的制备成为了限制红藻产业高值化利用的关键性因素。目前，工业级的琼胶酶制剂市场还属空白，商用级的琼胶酶价格高昂，仅供研究使用。根据报道的数据进行调研，大多数产琼胶酶的菌株的活性较低，产量较低，阻碍了红藻产业的深度发展。因此，开发活性高、产量高、安全性高的琼胶酶，形成成熟的、低成本琼胶酶制备方法成为了本
的当务之急。
技术实现思路
本专利技术分离纯化出一株来源于海洋的交替假单胞菌Q30F（Pseudoalteromonassp.Q30F），其特征是产生琼胶酶，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏号：CCTCCNo：M2017622，保藏日期：2017年10月23日。本专利技术的目的是提供一种来源于海洋的菌株Pseudoalteromonassp.Q30F、编码琼胶酶的基因序列及蛋白氨基酸序列。本专利技术还提供了用于以高产率制备有效的琼胶酶的方法，并且其可在工业规模应用不存在困难。本专利技术涉及一株来源于海洋的交替假单胞菌。经过基因测序技术，遗传标志是包含序列表SEQ.ID.No.1所示的16SrDNA核酸序列，通过在GenBank数据库同源比对和生理生化鉴定，确定其为交替假单胞菌Q30F，命名为Pseudoalteromonassp.Q30F。本专利技术涉及包含如SEQ.ID.NO.10所示的氨基酸序列的琼胶酶。本专利技术所研究并公开的琼胶酶，氨基酸序列如SEQIDNo.7或10所示。本专利技术同时涉及核苷酸序列，其特征在于编码氨基酸序列如SEQIDNo.7或10所示的琼胶酶，核苷酸序列如SEQIDNO.4或SEQIDNO.8所示。本专利技术同时涉及重组载体，其包含如SEQIDNO.4或SEQIDNO.8所示的核酸分子。根据本专利技术，这些目的和下文中会变得更明显的其他目的，是通过如下制备琼胶酶的方法实现的。利用本专利技术的公开的SEQIDNO.4中所示的核苷酸序列的载体，经过基因重组、诱导表达、发酵培养获得含琼胶酶的发酵液。本专利技术的这些目的也可以通过发酵的方法获得的包含SEQ.ID.No.10的源自Pseudoalteromonassp.Q30FCCTCCNo：M2017622的琼胶酶（SEQ.ID.No.7）来实现。本专利技术的这些目的也已经通过包含SEQ.ID.No.4中示出的核苷酸序列的多核苷酸实现，其编码包含SEQ.ID.No.10中示出的氨基酸序列的细菌琼胶酶。本专利技术的这些目的也已经通过包含所述多核苷酸的基因工程化重组载体实现。本专利技术的这些目的已经通过包含所述基因工程化重组载体的宿主细胞实现。本专利技术的这些目的也已经通过包含纯化形式并且包含SEQ.ID.No.7或SEQ.ID.No.10中示出的氨基酸序列的来自Pseudoalteromonassp.Q30FCCTCCNo：M2017622的所述琼胶酶具有如下用途之一或二种以上：1）作为工具酶降解红藻或大分子琼胶产生小分子琼胶糖链；2）作为工具酶，降解琼胶定向制备不同凝胶度的琼胶；3）降解新鲜红藻类细胞壁，游离出原生质体或单胞藻，用于养殖或遗传研究；4）与其他制剂耦合联用，制备富含以特征性琼胶寡糖为主的海洋酵素、饮品或食品；5）用于制备化妆品级、医药级的琼胶糖链。在本专利技术的范围内，“源自或来自Pseudoalteromonassp.Q30FCCTCCNo：M2017622的琼胶酶”意指与原始分离自Pseudoalteromonassp.Q30FCCTCCNo：M2017622生物体的琼胶酶具有高度同源性的琼胶酶，其能够通过生物技术从除Pseudoalteromonassp.Q30FCCTCCNo：M2017622之外的微生物（例如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌）产生。相比于现有技技术，根据本专利技术的方法能够。从特征在于安全的来源于大肠杆菌E.coli的菌株或枯草芽孢杆菌获得琼胶酶，并且通过重组技术（代替通过提取的方式）生产，从而适合于工业规模生产，并且目的蛋白在在胞外基质或细胞内中产生。本专利技术采用原核表达系统成功实现细菌来源的琼胶酶异源高效活性表达，表达琼胶酶操作及其纯化制备方法简单。在未对细菌琼胶酶基因做任何修饰的情况下，构建基因工程菌株（大肠杆菌或枯草芽孢杆菌），其具有培养条件简单，发酵时间短，生产强度大。本专利技术为实现细菌来源琼胶酶的工业化制备生产奠定了基础。附图说明提供一下附图以更好地描述本专利技术，而不是意在限制本专利技术的范围。图1：在1％琼脂糖凝胶中进行在生产步骤中琼胶酶基因PCR验证实验。经PCR获得1338bp片段分布的实验。图2：来源于Pseudoalteromonassp.Q30FCCTCCNo：M2017622的如SEQ.ID.No.7所示的蛋白信号肽分析。图3：:来源于Pseudoalteromonassp.Q30FCCTCCNo：M2017622的Agarase分子量和等电点的确定。图4：来源于Pseudoalteromonassp.Q30FCCTCCNo：M2017622的AgaraseNS分子量和等电点的确定。具体实施方式本专利技术人经过长期的研究，首次揭示来源于Pseudoalteromonassp.Q30FCCTCCNo：M2017622琼胶酶。本专利技术的琼胶酶蛋白稳定性好，生物活性高。本专利技术还公开了含有琼胶酶基因的表达载体和宿主细胞，以及表达琼胶酶的方法。根据本专利技术的技术方案，可以实现以较低的成本大量生产重组琼胶酶。...

【技术保护点】
1.一种琼胶酶，其特征在于包含如SEQ. ID. NO.10所示的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种琼胶酶，其特征在于包含如SEQ.ID.NO.10所示的氨基酸序列。


2.根据权利要求1所述琼胶酶，氨基酸序列如SEQIDNo.7或10所示。


3.一种核苷酸，其特征在于编码权利要求1或权利要求2所述的琼胶酶。


4.根据权利要求3所述的核苷酸，其特征在于核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。


5.根据权利要求3所述的核苷酸，其特征在于核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。


6.重组载体，其包含权利要求3-5任一项所述的核酸分子。


7.如权利要求6所述的载体，其特征在于具有包含如SEQIDNo.7或10所示的核苷酸序列。


8.重组细胞，其包含权利要求6或7所述的载体。


9.如权利要求8所述的重组细胞，选自大肠杆菌菌株HXAg-HTa-BL21、Ag-HTa-BL21，或选自选自枯草芽孢杆菌菌株Agarase-pHT43-WB800N、AgaraseNS-pHT43-WB800N。

【专利技术属性】
技术研发人员：江晓路，朱常亮，崔欣，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37