一种促进TFEB核转位的短肽及基于其的线性短肽和其减轻脑缺血损伤的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种促进TFEB核转位的短肽及基于其的线性短肽和其减轻脑缺血损伤的应用，属于生物医药技术领域。本发明专利技术公开的短肽是一种由TFEB蛋白与14‑3‑3蛋白结合的功能区域融合而成的短肽，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。本发明专利技术还公开了保护上述短肽的线性短肽，由穿膜肽与上述短肽融合而成。本发明专利技术通过实验验证了合成的融合肽能够调控TFEB核转位，促进CMA减轻细胞损伤。因此，公开了其减轻神经元死亡以及改善脑缺血损伤的治疗新靶点的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种促进TFEB核转位的短肽及基于其的线性短肽和其减轻脑缺血损伤的应用
本专利技术属于生物医药
，涉及促进TFEB核转位增强分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediatedautophagy，CMA)减轻神经损伤的短肽及其应用，具体涉及一种促进TFEB核转位的短肽及基于其的线性短肽及其减轻脑缺血损伤的应用。
技术介绍
脑卒中严重威胁人类生命健康，全球每年约有1690万新发卒中患者，590万病人死于卒中相关性疾病；另有3300万卒中病人需要长期治疗、照顾，给社会和家庭带来了沉重的负担(Lancet，2017)。tPA(Tissueplasminogenactivator)是目前美国FDA批准治疗缺血性卒中的唯一药物，但其治疗时间窗短、增加出血风险，仅有4-7％的患者从中受益。因此，进一步阐明卒中的病理机制，寻找可靠的药物靶点，对开发卒中的干预措施和治疗药物具有重要意义。自噬(Autophagy)的发现，是人们认识细胞存活的一次飞跃，开创了机体维持内环境稳态、减少细胞死亡的新纪元，也为缺血性脑卒中的防治提供了新思路。大量研究证实，多种预处理方式及雷帕霉素可通过促进自噬减轻脑缺血损伤。申请者研究团队发现，高压氧(Hyperbaricoxygen,HBO)预处理可通过增强神经元自噬减轻脑缺血损伤；最新研究也证实，上调星形胶质细胞的自噬流水平，可减少脑缺血后神经。但迄今为止，自噬加重还是减轻脑缺血损伤仍存争议(ProgressinNeurobiology，2018)；相关研究也指出用3-MA或Beclin-1RNAi抑制自噬可减轻脑缺血后神经损伤。自噬究竟加重还是减轻脑缺血损伤，重新审视“自噬影响脑缺血损伤预后的核心机制”迫在眉睫。在近期研究中，申请人课题组利用iTRAQ高通量蛋白质组学技术筛选出内源性脑保护作用的效应分子CystatinC；并通过构建基因敲除大鼠验证，发现CystatinC可通过保护自噬的最关键部分——溶酶体，从而减轻脑缺血损伤(ZPFangetal.Stroke，2017)。在探索CystatinC通过哪些途径及下游信号分子保护溶酶体的研究中，我们发现在CystatinC基因敲除大鼠脑内，调控自噬-溶酶体通路的关键因子——TranscriptionFactorEB(TFEB)表达显著降低。同时，我们意外地发现TFEB降低情况下，溶酶体膜的重要成分、也是调节分子伴侣介导自噬(Chaperone-mediatedautophagy，CMA)的关键蛋白——Lysosome-associatedmembraneprotein2A(LAMP-2A)显著减少。这一新发现促使我们思索自噬调节细胞存活的核心机制是什么。根据细胞内物质传送至溶酶体的具体方式，自噬可分为大自噬(Macroautophagy)、小自噬(Microautophagy)以及分子伴侣介导的自噬(CMA)。以往研究多集中于大自噬，3-MA或Beclin-1RNAi等干预措施也只能调节大自噬。但大自噬降解底物无选择性——既可降解受损蛋白、细胞器；也可由于自噬过度，过多地降解细胞自身正常成分，造成细胞死亡。这可能是导致自噬影响脑缺血损伤预后出现争议性结果的重要原因。反观CMA，是一种具有靶向降解错误折叠蛋白的自噬类型。调控CMA是否才是减轻脑缺血损伤的关键，自噬-溶酶体通路的关键调节因子TFEB是否可以调控CMA减轻脑缺血损伤，经过检索发现，目前并没有这方面的任何研究报道。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种促进TFEB核转位的短肽及基于其的线性短肽和其减轻脑缺血损伤的应用。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术公开了一种促进TFEB蛋白核转位的短肽，该短肽是基于TFEB蛋白与14-3-3蛋白结合的功能区域合成的短肽，该短肽的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。本专利技术还公开了含有上述的促进TFEB蛋白核转位的短肽的线性短肽，该线性短肽是由促进TFEB蛋白核转位的短肽与穿膜肽融合而成。优选地，所述穿膜肽选择TAT，则融合而成的线性短肽的序列如SEQ.ID.NO.2所示。优选地，所述穿膜肽选择SynB3，则融合而成的线性短肽的序列如SEQ.ID.NO.4所示。本专利技术还公开了上述的线性短肽在制备治疗脑卒中及神经细胞损伤药物中的应用。优选地，所述的药物为促进TFEB核转位调节细胞功能发挥的药物。优选地，所述的药物为通过竞争性结合14-3-3蛋白促进TFEB蛋白核转位增强分子伴侣介导的自噬的药物。优选地，所述的药物为减轻脑缺血损伤、改善神经功能的药物。本专利技术还公开了上述的线性短肽在制备退行性神经系统疾病的药物中的应用。优选地，所述的药物能够通过静脉注射给药，自由透过血脑屏障。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术首次公开了一种能够促进TFEB蛋白核转位的短肽，该短肽由TFEB蛋白与14-3-3蛋白结合的功能区域融合而成。传统大自噬在降解底物时无选择性，在清除受损蛋白及细胞器的同时，也会降解自身正常成分。而分子伴侣介导的自噬(CMA)可以保留细胞中的正常蛋白，清除因氧化性损伤造成的无功能蛋白；这种更具选择性的蛋白降解途径，更有助于维持细胞内环境的稳定性。将研究目标从传统大自噬转向CMA，成为调控自噬减轻脑缺血损伤的突破口。经过试验验证，本专利技术短肽Tat-S211能够有效促进TFEB核转位，增加CMA相关蛋白的表达，同时减轻神经元及缺血性卒中后的神经损伤。进一步地，本专利技术的上述短肽能够与穿膜肽融合成一条线性短肽，能够减少目的肽的分子量，增加穿膜肽的穿膜效率，以保证其能够透过血脑屏障，进入细胞内。更进一步地，为了能够快速、特异地调节TFEB转录活性，本专利技术合成的线性短肽(选择穿膜肽TAT)TAT-S211只有21个氨基酸，TAT-S211可明显促进神经元TFEB核转位，并增加CMA的关键单位LAMP-2A和Hsc70的表达，显著减少OGD后细胞死亡。该线性短肽不仅减少了机体的免疫排斥反应，其合成成本也较低，将其作为生物活性分子，应用于制备脑卒中药物，前景十分广阔。附图说明图1A为siRNA干扰原代神经元TFEB表达后，CMA标记蛋白表达的Westernblot图。图1B为siRNA抑制TFEB核转位后OGD神经元的损伤图。图2为本专利技术的短肽Tat-S211促进TFEB核转位的免疫荧光图。图3A为本专利技术的短肽Tat-S211促进CMA标记蛋白表达的Westernblot图。图3B为Tat-S211减轻神经元OGD损伤的效果图。图4为MCAO小鼠神经元TFEB核转位减少的免疫荧光图。图5为Tat-S211促进MCAO小鼠TFEB核转位效果的Westernblot图；其中，A显示对细胞浆里含量无影响；B显示增加细胞核里蛋白含量。图6为Tat-S211减轻小鼠脑缺血损伤的效果图。其中，A为Tat-S21本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种促进TFEB蛋白核转位的短肽，其特征在于，该短肽是基于TFEB蛋白与14-3-3蛋白结合的功能区域合成的短肽，该短肽的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种促进TFEB蛋白核转位的短肽，其特征在于，该短肽是基于TFEB蛋白与14-3-3蛋白结合的功能区域合成的短肽，该短肽的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。


2.含有权利要求1所述的促进TFEB蛋白核转位的线性短肽，其特征在于该线性短肽是由促进TFEB蛋白核转位的短肽与穿膜肽融合而成。


3.如权利要求2所述的线性短肽，其特征在于，所述穿膜肽选择TAT，则融合而成的线性短肽的序列如SEQ.ID.NO.2所示。


4.如权利要求2所述的线性短肽，其特征在于，所述穿膜肽选择SynB3，则融合而成的线性短肽的序列如SEQ.ID.NO.4所示。


5.权利要求2～4中任意一项所...

【专利技术属性】
技术研发人员：方宗平，冯云，侯武刚，张西京，熊利泽，董海龙，苏斌虓，李雨衡，王佳佳，王世全，王进，邓姣，杨博，左文强，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61