一种抑制结直肠癌致病菌的益生菌配方及其筛选方法组成比例

本发明专利技术公开了一种抑制结直肠癌致病菌的益生菌配方及其筛选方法，益生菌的筛选方法为：根据正常人和结直肠癌患者的肠道菌群的宏基因组数据及丰度找到结直肠癌致病菌，然后构建肠道菌群互作网络筛选可抑制结直肠癌致病菌的益生菌，调节益生菌配比最后进行验证。利用该方法得到的益生菌配方为：丁酸梭菌1.3×10

【技术实现步骤摘要】
一种抑制结直肠癌致病菌的益生菌配方及其筛选方法
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种抑制结直肠癌致病菌的益生菌配方及其筛选方法。
技术介绍
结直肠癌(colorectalcancer,CRC)，是人类常见的恶性肿瘤，目前被列为世界第三大癌症。随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变，其发病率和死亡率呈上升趋势，严重威胁着人类的健康。已有大量研究报道CRC与多种因素有关，如肥胖、糖尿病、久坐生活方式、高脂肪饮食、吸烟、酗酒、年龄、性别、家族史等，但其确切的发病机制仍不明确。今年越来越多的研究提出肠道菌群是CRC进展相关的一个非常重要因素。肠道菌群，作为一个类器官，与宿主肠道粘膜上皮细胞和免疫细胞有着深层的相互作用关系，其组成、数量及活性，在许多生理过程中，尤其是在炎症和免疫反应中，起着至关重要的作用。肠道菌群已被证实可能是癌症发展的枢纽点，并直接或间接参与肠道肿瘤的发生。有文献报道在结肠癌中肠道菌群的组成发生了变化，提示肠道菌群生态失衡在结直肠癌发生发展中发挥着重要作用。一些细菌的物种，如粪肠球菌、大肠杆菌、具核梭杆菌、溶血性链球菌和脆弱拟杆菌等在CRC患者的粪便和肿瘤组织中有较高的比例，而产丁酸盐的细菌在CRC患者中消耗殆尽。开发一种药物，抵抗结直肠癌患者肠道中的致病菌，恢复癌症患者的肠菌稳态，有可能成为治疗结直肠癌的一个有效手段。目前，抗生素的滥用已造成了如耐药等一系列的困扰人们的棘手问题，人类急需寻找一种可以“替代”抗生素的抗菌治疗药物。而益生菌能通过殖民抵抗的机制，即与病原菌竞争粘附位置，抵抗病原菌的侵袭，调节宿主的免疫反应，保护人体免疫系统。另外，益生菌比致病菌更耐酸，而且其可以产生有机酸等酸性物质，营造酸性微环境，从而抑制致病菌的生长。益生菌的使用可以对抗CRC患者肠道菌群的失调，从而恢复疾病导致的肠菌生态失衡，减少细菌引起的炎症、遗传毒性、致癌途径等。然而，目前这种益生菌的靶向治疗方法尚未在CRC中进行深入的研究，其使用仍存在一定的局限性。益生菌的抗菌活性较小，菌株在肠道中的定殖能力较差，如何将其开发成能发挥稳定药效的药物具有一定的难度；其受环境、饮食等因素影响较大，目前还没有针对中国人体质的益生菌产品。开发益生菌药物有重大的意义，也面临着急剧的挑战。中国专利CN107937504A公开了一种抗猪大肠杆菌感染的饲用益生菌的筛选方法，包括以下步骤：大肠杆菌感染发病仔猪和抗病仔猪的筛选及其肠道内容物样品的采集；大肠杆菌感染发病仔猪和抗病仔猪肠道微生物菌群的高通量测序；大肠杆菌感染发病仔猪和抗病仔猪肠道微生物宏基因组学对比分析；以及抗大肠杆菌感染的益生菌的筛选及鉴定，然而目前可收集到的抗结直肠癌致病菌的样本很少，无法采用该方法进行抗结直肠癌致病菌的益生菌的筛选，同时该方法没有从肠道菌群的生态整体出发去筛选益生菌，因此筛选得到的益生菌配方可能在肠道内的定殖能力差。
技术实现思路
针对现有技术的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种安全、有效、可更好定殖于肠道，抑制结直肠癌致病菌的益生菌配方及其筛选方法为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种抑制结直肠癌致病菌的益生菌配方的筛选方法，由以下步骤组成：S1.构建人体肠道微生物组在线仓库数据库(GMrepo,http://gmrepo.humangut.info/home)，该数据库收录了58,903个人体肠道样本，253个项目，基于所述人体肠道微生物组在线仓库数据库，搜索并下载正常人和结直肠癌患者的肠道菌群的宏基因组数据，并对所述宏基因组数据进行质量控制，即修剪和去除原始数据中的接头和低质量序列，包含双端测序和单端测序两种模式，然后对质量控制后的宏基因组数据进行评价，，得到质控后的宏基因组数据；S2.对所述质控后的宏基因组数据进行宏基因组物种注释分析，得到正常人和结直肠癌患者的肠道菌群的物种的丰度信息；S3.基于所述质控后的宏基因组数据和所述丰度信息，分析正常人与结直肠癌患者之间肠道菌群的差异，并进一步筛选，得到正常人和结直肠癌患者中存在差异的差异菌，将所述差异菌输入到所述人体肠道微生物组在线仓库数据库中，查看所述差异菌在正常人的肠道菌群中的丰度，其中在正常人的肠道中不存在的菌被鉴定为结直肠癌致病菌；S4.根据S2中所述丰度信息，分别选取正常人和结直肠癌患者的肠道菌群的物种的丰度排名前50的细菌，将其合并后根据基因尺度代谢网络模型，从文献中获取所述合并后的细菌在肠道中单独培养以及两两共同培养的条件下的生长率，并基于所述生长率构建肠道菌群互作网络；S5.基于S4所述的肠道菌群互作网络和细菌间拮抗原理，筛选抑制S3中所述的结直肠癌致病菌的益生菌，合并所有抑制致病菌的益生菌后从以下两方面对所述益生菌做进一步的筛选：一是排除会促进其他致病菌生长的益生菌；二是尽量避免益生菌之间的相互抑制作用；S6.结合所述益生菌在正常人的肠道菌群的丰度，对S5中所述的益生菌进行优化，调节各益生菌的配比，最终得到可抑制结肠癌致病菌的益生菌配方；S7.对S6中所述益生菌配方进行实验动物体内验证：建立结直肠癌小鼠模型；制备S6中所述益生菌配方的益生菌悬液，将结直肠癌小鼠随机分成低剂量组、高剂量组和空白对照组，其中低剂量组和高剂量组小鼠分别灌胃等体积的低浓度和高浓度的益生菌悬液，空白对照组小鼠灌胃等体积的生理盐水，每天灌胃一次，连续灌胃28天。在小鼠灌胃后第0d、7d、14d、21d、28d分别在无菌条件下取等质量的小鼠肠道内容物，备宏基因组测序，分析在灌胃前后结直肠癌小鼠粪便中致病菌和益生菌的丰度，从而确定所述益生菌配方对结肠癌致病菌的抑制效果。优选地，S1中采用Trimmomatic软件进行所述质量控制，采用Fastqc软件进行所述质量控制后的评价，这两个软件均是本领域的常用软件。优选地，S2中采用MetaPhIAn2软件进行所述宏基因组物种注释分析，该软件整理了17000多个参考基因组，包括13500个细菌和古菌，3500个病毒和110种真核生物，下载对应的数据库后，采用该软件可以实现精确的分类群分配以及准确的计算物种的相对丰度，其能达到种水平的精度，以及菌株水平的鉴定和追踪。优选地，S3中采用本领域常用软件LefSe进行所述分析，采用随机森林算法进行所述差异菌的筛选，随机森林算法利用多棵决策树的集成学习策略，对样本进行训练并进行预测，输入LEfSe分析筛选得到的结直肠癌中存在显著差异的菌，随机森林可以很容易的查看模型输入特征的相对重要性，并识别癌症患者和正常人，最终得到正常人和结直肠癌患者中存在差异的差异菌。优选地，S4中将细菌在肠道中单独培养的生长率记为S，将细菌在肠道中两两共同培养的生长率记为P，计算细菌之间的权重W＝log2(P/S)，以所述合并后的细菌为节点，以菌株之间的权重W为边，利用本领域常用的开源软件Gephi绘制所述肠道菌群互作网络，同时采用Gephi软件中的modularityalgorithm功能鉴定肠菌代谢网络中的亚群，采用Gephi软件自带的Page本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抑制结直肠癌致病菌的益生菌配方的筛选方法，其特征在于，由以下步骤组成：/nS1.构建人体肠道微生物组在线仓库数据库，基于所述人体肠道微生物组在线仓库数据库，搜索并下载正常人和结直肠癌患者的肠道菌群的宏基因组数据，并对所述宏基因组数据进行质量控制，对质量控制后的宏基因组数据进行评价，得到质控后的宏基因组数据；/nS2.对所述质控后的宏基因组数据进行宏基因组物种注释分析，得到正常人和结直肠癌患者的肠道菌群的物种的丰度信息；/nS3.基于所述质控后的宏基因组数据和所述丰度信息，分析正常人与结直肠癌患者之间肠道菌群的差异，并进一步筛选得到正常人和结直肠癌患者中存在差异的差异菌，将所述差异菌输入到所述人体肠道微生物组在线仓库数据库中，查看所述差异菌在正常人的肠道菌群中的丰度，鉴定出结直肠癌致病菌；/nS4.根据S2中所述丰度信息，分别选取正常人和结直肠癌患者的肠道菌群的物种的丰度排名前50的细菌，将其合并后根据基因组尺度代谢网络模型，从文献中获取所述合并后的细菌在肠道中单独培养以及两两共同培养的条件下的生长率，并基于所述生长率构建肠道菌群互作网络；/nS5.基于S4所述的肠道菌群互作网络，筛选抑制S3中所述的结直肠癌致病菌的益生菌；/nS6.结合所述益生菌在正常人的肠道菌群的丰度，对S5中所述的益生菌进行优化，得到抑制结肠癌致病菌的益生菌配方；/nS7.对S6中所述益生菌配方进行实验动物体内验证。/n...

【技术特征摘要】
1.一种抑制结直肠癌致病菌的益生菌配方的筛选方法，其特征在于，由以下步骤组成：
S1.构建人体肠道微生物组在线仓库数据库，基于所述人体肠道微生物组在线仓库数据库，搜索并下载正常人和结直肠癌患者的肠道菌群的宏基因组数据，并对所述宏基因组数据进行质量控制，对质量控制后的宏基因组数据进行评价，得到质控后的宏基因组数据；
S2.对所述质控后的宏基因组数据进行宏基因组物种注释分析，得到正常人和结直肠癌患者的肠道菌群的物种的丰度信息；
S3.基于所述质控后的宏基因组数据和所述丰度信息，分析正常人与结直肠癌患者之间肠道菌群的差异，并进一步筛选得到正常人和结直肠癌患者中存在差异的差异菌，将所述差异菌输入到所述人体肠道微生物组在线仓库数据库中，查看所述差异菌在正常人的肠道菌群中的丰度，鉴定出结直肠癌致病菌；
S4.根据S2中所述丰度信息，分别选取正常人和结直肠癌患者的肠道菌群的物种的丰度排名前50的细菌，将其合并后根据基因组尺度代谢网络模型，从文献中获取所述合并后的细菌在肠道中单独培养以及两两共同培养的条件下的生长率，并基于所述生长率构建肠道菌群互作网络；
S5.基于S4所述的肠道菌群互作网络，筛选抑制S3中所述的结直肠癌致病菌的益生菌；
S6.结合所述益生菌在正常人的肠道菌群的丰度，对S5中所述的益生菌进行优化，得到抑制结肠癌致病菌的益生菌配方；
S7.对S6中所述益生菌配方进行实验动物体内验证。


2.如权利要求1所述的一种抑制结直肠癌致病菌的益生菌配方的筛选方法，其特征在于，S1中采用Trimmomatic软件进行所述质量控制，采用Fastqc软件进行所述质量控制后的评价。


3.如权利要求1所述的一种抑制结直肠癌致病菌的益生菌配方的筛选方法，其特征在于，S2中采用MetaPhIAn2软件进行所述宏基因组物种注释分析。


4.如权利要求1所述的一种抑制结直肠癌致病菌的益生菌配方的筛选方法，其特征在于，S3中采用LefSe进行所述分析，采用随机森林算法进行所述差异菌的筛选。


5.如权利要求1所述的一种抑制结直肠癌致病菌的益生菌配方的筛选方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈卫华，江浦滋，吴思成，聂庆庆，刘智，
申请(专利权)人：君维安武汉生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42