一种产黄青霉的固定化方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种产黄青霉的固定化方法及其应用，将电晕改性后的塑料介质作为固定化载体，将产黄青霉活化后接入固定化发酵培养基中培养，使菌株在培养的过程中吸附于载体上此外。本发明专利技术中以塑料介质为惰性材料，实现了产黄青霉的高密度发酵，降低发酵液的粘度，发酵液的黏度适中，传质效果很好。在与游离发酵相比，产物的效价大大提高，青霉素的效价达到1672.65U/mL，有效缩短发酵总周期从21天缩短到18天。

Immobilization of Penicillium chrysogenum and its application

【技术实现步骤摘要】
一种产黄青霉的固定化方法及其应用
本专利技术属于工业生物
，具体涉及一种产黄青霉的固定化方法及其应用。
技术介绍
早在1929年，AlexanderFleming发现了在平板上抑制金黄色葡萄球菌的物质，后来命名为青霉素。青霉素(Penicillin)可以被命名为多种名称，比如：青霉素G、盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾，而现在用于治疗的很多抗生素都是来源于其弗莱明发现的β-内酰胺抗生素的衍生物。青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提炼的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素。青霉素类抗生素是β-内酰胺类中的一大类抗生素的总称。青霉素作为一种毒素低、治疗效果好的抗生素，目前仍然是临床上重要的抗生素之一。产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)属于子囊菌亚门，不整囊菌纲，散囊菌目，散囊菌科，青霉属。产黄青霉是一种广泛存在于自然界中的霉菌，特别在潮湿的食物和环境中最为常见。产黄青霉最适宜生长的温度25-28℃不等，营养的要求不是很严格，所以，培养也比较容易。最早应用于生产青霉素的菌是点青霉，而现在是用产黄青霉，根据其菌丝的状态，可以将产黄青霉分为丝状菌和球状菌，在丝状菌和球状菌中还可以再按照孢子的颜色分为不同的菌，而我们现在用于青霉素生产的主要是绿孢子丝状菌。因为其菌落的形态和孢子独特的颜色，所以产黄青霉的菌落形态很容易辨认。但是，在工业生产中，由于种子培养时间长的问题使得发酵周期延长很多，发酵液也很粘稠，最终不利用产物的分离，菌体也容易老化。于是，固定化的技术得到很多的关注，技术也越发成熟，从而广泛的应用于生物技术生产的各大领域。让菌体与一些适合固定化发酵的材料接触，菌体吸附在载体上，从而降低发酵液的浓度有利于营养物质的传递，此外，这些惰性的材料可以重复利用，即提高了发酵效率又有益于产物的分离，材料的重复利用，降低了生产成本的同时，也起到了环境保护的作用。目前，细胞的固定化方法主要有：包埋法和吸附法，在我国细胞的固定化主要采用的是包埋法。但是，对于产黄青霉的固定化我们了解的很少，之前就报道海藻酸钙对产黄青霉的固定化，但是这种对细胞的固定化引入了副产物，对于后期的产物分离不是有利的，后期也会造成青霉素产量的损失。现在基于黑曲霉固定化的方法，我们也专利技术了一种产黄青霉固定化发酵的方法，就是在天然存在的惰性介质中，寻找一种适合产黄青霉生长的载体，使得发酵的效率能够提高，降低生产的成本，这就是我们在这过程中需要解决的问题。随着技术的发展，近些年各种新型的惰性材料层出不穷，然而，在固定化的过程中，我们发现塑料介质作为介质进行固定化发酵，不仅无毒，而且工艺体现也很稳定，惰性材料很容易获得，产物分离以后还可以重复的利用，大大降低生产成本，更重要的是对活性细胞起到一定的保护作用，所以对于固定化发酵的效果非常显著，然而，青霉菌作为丝状菌，因为其菌丝长，菌体生长快，所以很少有人采用吸附法进行固定化发酵。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种产黄青霉的固定化方法，使产黄青霉的固定化既简单又方便，且固定化的过程稳定高效。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种产黄青霉的固定化方法，其将经过电晕改性后的塑料介质作为固定化载体，将产黄青霉活化后接入固定化发酵培养基中培养，使菌株在培养的过程中吸附于载体上。其中，所述的产黄青霉为ATCC48271。其中，所述的塑料介质为聚甲基丙烯酸甲酯。其中，所述的塑料介质以15～20g/L(优选15g/L)的添加量置于固定化发酵培养基中。其中，电晕改性包括如下步骤：(1)将塑料介质在去离子水中清洗1-5次(2～10min)，再将清洗后的塑料介质在丙酮中抽提15～30h，去除表面油污和杂质，于烘箱45℃烘干30～60min；(2)将步骤(1)处理后的塑料介质进行电晕处理，保存备用。步骤(1)中，所述的抽提为循环抽，提纯溶剂丙酮一次性直接加50mL/0.1g。步骤(2)中，所述电晕处理的设备是SDCD16-3-20；所述电晕的电流强度为6～14A(优选8A)；电晕的时间为10～30min(优选15min)；其中，电晕的原理是在介质表面持续放电，本专利技术采用电晕是为了改变基团性质，以使介质的亲水性更好。其中，所述的固定化发酵培养基中各组分的质量百分比为黄豆饼粉4.65％、碳酸钙1％、乳糖3％、磷酸二氢钾0.5％、硫酸铵0.4％、硫酸钠0.15％、色拉油0.03％、苯乙酸2.5％，pH＝5.8。其中，黄豆饼粉作为一种有机氮源，但确比常见的玉米浆更适合产黄青霉的固定化，且来源广泛易获得；色拉油作为多种植物油的混合体比起传统的玉米油则可以更加有效的减少气泡，所含的物质更适合青霉的发酵。其中，所述的培养为25℃，培养3天。上述方法所制备得到的固定化的产黄青霉也在本专利技术的保护范围之内。上述固定化的产黄青霉在生产青霉素中的应用在本专利技术的保护范围之内。其中，所述的应用为：将固定化的产黄青霉接种于换液固定化发酵培养基中是，在20～30℃、150～300rpm，摇床培养72～96h；其中，所述的换液固定化发酵培养基各组分的质量百分比为黄豆饼粉4.65％、碳酸钙1％、乳糖3％、磷酸二氢钾0.5％、硫酸铵0.4％、硫酸钠0.15％、色拉油0.03％、苯乙酸2.5％，pH＝5.8。优选地，是在25℃、220rpm，摇床培养72～96h。其中，具体的发酵过程包括如下步骤：(1)于-80℃冰箱取出冷冻保藏的产黄青霉甘油菌在平板上划线活化，在25℃培养3天。(2)3天后待孢子成熟，用刮孢子液(0.9％NaCl+吐温80)将孢子收集，接种于500mL摇瓶中，其中装液量为100mL，于25℃，220rmp摇床培养72-96h，测定发酵液中的苯乙酸浓度，当其低于0.01％，结束一批发酵，然后移出发酵液。(3)固定化反复批次发酵：配置新鲜的培养液1L。然后500mL锥形瓶分装100mL，于115℃，20min灭菌。结束灭菌以后，将第一批次的菌液倒掉，然后再超净台将新鲜的培养液倒入。这样反复进行9批。有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下优势：1、在本专利技术中，我们所采用的塑料介质为惰性材料，化学性质及其稳定，而且在发酵的过程中对细胞不会产生毒害作用，所承受的机械强度也很高，且不会被分解代谢掉，经过我们对其改性以后均匀度也很好，不会造成产黄青霉在载体上过度的生长且分布均匀。2、本专利技术中，在发酵过程当中，死细胞的脱落和活细胞的吸附使此过程处于一个动态平衡的状态，从而减少发酵过程中对细胞的损害，大大减少发酵的总时间以及发酵的成本，有效缩短发酵总周期从21天缩短到18天。3、选用的最优的塑料介质，因其具有较小的接触角，所以在单位体积里固定化的细胞数目比较多，不仅如此，由于固定化细胞的密度高，所以实现了产黄青霉的高密度发酵本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产黄青霉的固定化方法，其特征在于，将电晕改性后的塑料介质作为固定化载体，将产黄青霉活化后接入固定化发酵培养基中培养，使菌株在培养的过程中吸附于载体上。/n

【技术特征摘要】
1.一种产黄青霉的固定化方法，其特征在于，将电晕改性后的塑料介质作为固定化载体，将产黄青霉活化后接入固定化发酵培养基中培养，使菌株在培养的过程中吸附于载体上。


2.根据权利要求1所述的固定方法，其特征在于，所述的产黄青霉为ATCC48271。


3.根据权利要求1所述的固定方法，其特征在于，所述的塑料介质为聚甲基丙烯酸甲酯。


4.根据权利要求1所述的固定方法，其特征在于，所述的塑料介质以15～20g/L的添加量置于固定化发酵培养基中。


5.根据权利要求1所述的固定方法，其特征在于，电晕改性包括如下步骤：
(1)将塑料介质在去离子水中清洗，再将清洗后的塑料介质在丙酮中抽提15～30h，干燥；
(2)将步骤(1)处理后的塑料介质进行电晕处理，保存备用。


6.根据权利要求5所述的固定方法，其特征在于，步骤(2)中，电晕的电流强度为6～14A；电晕的时间为...

【专利技术属性】
技术研发人员：应汉杰，王芳娟，陈勇，丁赛，刘丽，俞莹，张德力，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32