一种用于大熊猫犬瘟热病毒检测的引物、探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于大熊猫犬瘟热病毒检测的引物、探针及试剂盒，引物及探针的设计以大熊猫源犬瘟热病毒giant panda/SX/2014株(Genbank：KP793921)为模板，旨在提高检测特异性，与犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬轮状病毒(CRV)等其他病毒不存在交叉反应，在用于大熊猫犬瘟热病毒检测时，灵敏度高，检出限为5×10

A primer, probe and kit for detection of canine distemper virus in giant panda

【技术实现步骤摘要】
一种用于大熊猫犬瘟热病毒检测的引物、探针及试剂盒
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种应用重组酶聚合酶等温扩增技术(RecombinasePloymeraseAmplification，RPA)并结合核酸检测试纸条检测犬瘟热病毒的引物、探针及试剂盒。
技术介绍
犬瘟热(Caninedistemper，CD)是由犬瘟热病毒(Caninedistempervirus，CDV)感染引起的犬和其他肉食动物的一种急性、高度接触性传染病。犬瘟热最初被描述为一种犬的传染病，随着病毒的不断进化和跨种传播，近年来CDV的宿主范围不断扩大，已由传统的犬科、浣熊科和鼬科扩展到猫科、灵猫科等所有陆地食肉目动物及非人灵长类动物。自1809年首次报道以来，该病呈现全球范围内流行的趋势，给伴侣动物、经济动物和野生物动物造成了严重的影响。近10年来，不断有犬瘟热在狮子、老虎等多种野生动物种群暴发的报道。随着CDV宿主范围的不断扩大，犬瘟热已成为威胁大熊猫种群数量和生命安全的第一大传染病。最早于1997年，重庆动物园共有3只大熊猫感染CDV，2只死亡。2014年12月-2015年4月，陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心22只圈养大熊猫暴发犬瘟热疫情，先后有6只CDV核酸检测呈阳性，其中5只大熊猫抢救无效相继死亡，给整个大熊猫种群带来了极大的威胁。犬瘟热导致的临床症状非常广泛，和其他疫病导致的临床症状相似，尤其是大熊猫、虎、猴子等野生动物表现有独特的临床特点，从而难以从临床症状上对犬瘟热进行有效诊断。整个疫情期间，大熊猫临床样品犬瘟热的诊断主要依赖于国家林业局(长春)野生动物疫病研究中心的PCR检测，需要克服长距离冷链运输样品。因此，适用于临床的快速的、灵敏的、特异的犬瘟热诊断方法已成为专业人员开展临床感染调查、及时制定隔离措施、防止疫情扩散和控制疫情的有力工具和必备条件。CDV在分类上属副黏病毒科、麻疹病毒属，是一种有囊膜的单股负链RNA病毒，基因组依次排列为3’-UTR-N-P(C,V)-M-F-H-L-UTR-5’，共编码核衣壳蛋白基因(N)、磷蛋白基因(P)、基质蛋白基因(M)、融合蛋白基因(F)、血凝素蛋白基因(H)、大聚合酶蛋白基因(L)，其中P基因还可通过RNA编辑和翻译起始位点的改变形成两个非结构蛋白C和V，在CDV所有结构蛋白中N蛋白的保守性最高，因此，N基因被广泛用于诊断方法的开发中。目前用于犬瘟热病毒的检测方法主要包括病原的分离鉴定、血清学方法和分子生物学的方法。病毒分离鉴定是最传统的检测方法，其特异性强，结果真实可靠，但是在实际操作中费时费力且敏感性低，因此，在临床应用中具有一定的局限性；血清学方法如酶联免疫吸附实验、中和试验、免疫荧光试验等需要制备特定抗原蛋白或特异性抗体，并且操作程序繁琐，不适合现场临床检测；针对犬瘟热病毒分子生物学检测方法主要有RT-PCR方法、荧光定量PCR方法、RT-LAMP方法等，但这些方法均需要精密的仪器设备和专业的技术操作人员，难以满足非实验室环境下野外或基层现场检测要求，因此，亟需建立一套快速、准确、简便的诊断方法，为现场检测、病原的监测及疫情预警提供新型的检测技术与物质基础。重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplification，RPA)是Piepenburg等于2006年首先提出的一种新型的恒温核酸扩增技术，其最显著的优势就是可在25～43℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，且能在5～20min观察结果。RPA技术设备要求低，水浴锅或体温即可满足扩增条件，扩增过程不仅可采用传统的反应管，还可在纸片等反应载体上进行。产物不仅可直接进行凝胶电泳检测，还可以与侧流层析试纸条相结合进行检测，实现扩增产物的定量分析或可视化判别。但传统的RPA易出现气溶胶污染，在实践中常常影响产物检测的特异性，而扩增产物转入层析试纸条的密闭核酸检测装置，为核酸扩增产物的检测过程提供密闭的环境，从而可降低核酸气溶胶污染的风险。RPA作为一种操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强、无需精密仪器的检测技术，是目前最有潜力成为快速分子诊断的工具，非常适用于现场快速检测(poind-of-caretesting，POCT)。随着英国TwistDx公司、国内江苏奇天基因等公司商品化试剂盒的开发加快了其在兽医传染病、食品安全、生物安全、农业等领域的应用。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术旨在提供一种用于大熊猫犬瘟热病毒检测的引物、探针以及试剂盒，具有灵敏度高、特应性强、操作简单快速、可视化等优点,通过与封闭式侧向流层析技术结合，不仅使病原检测更加易于判读，而且降低核酸气溶胶污染的风险，在基层现场犬瘟热病毒的可视化快速检测中具有广阔应用前景。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种用于大熊猫犬瘟热病毒检测的引物及探针，所述引物以Genbank登录号为KP793921的大熊猫源犬瘟热病毒giantpanda/SX/2014株为模板设计；所述引物的上游引物F为：5’-[Biotin]AACGGAGGACCGGACGATTCGCACTGCTGG-3’；所述引物的下游引物R为：5’-CATCATTGAAGTGGATGGGGTATTTGTCTC-3’；与所述引物对应的探针为：5’-[FITC]CTCTTGTTGATGGTTGGGGGTTGTTGATTGGT(THF)GACTTCGGATCTTTC[C3-Spacer]-3’。本专利技术还提供一种用于大熊猫犬瘟热病毒检测的试剂盒，包括上述引物及探针。进一步地，所述试剂盒还包括有RNA标准阳性品为：5’-GGCAUCACCAAGGAAGAGGCUCAGCUAGUGUCAGAAAUAGCAUCCAAGACAACGGAGGACCGGACGAUUCGCACUGCUGGUCCCAAGCAAUCUCAAAUCACUUUUCUGCACUCAGAAAGAUCCGAAGUCACCAAUCAACAACCCCCAACCAUCAACAAGAGGUCCGAAAACCAAGGAGGAGACAAAUACCCCAUCCACUUCAAUGAUGAACGAUUUUCAGGGUACACCCCUGAUGUCAACAGCUCCGAAUGGAGUGAA-3’。进一步地，作为一种优选方案，所述试剂盒还包括有通用型核酸检测试纸条。进一步地，作为进一步的优选方案，所述试剂盒还含有全封闭式核酸快速检测装置。进一步地，作为一种优选方案，所述试剂盒还包括重组酶、聚合酶、水解缓冲液、醋酸镁融合和RNaseFreeddH2O中的一种或几种。本专利技术的有益效果在于：本专利技术引物和探针的设计以大熊猫源犬瘟热病毒giantpanda/SX/2014株(Genbank：KP793921)为模板设计，旨在提高检测特异性，与犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬轮状病毒(CRV)等其他病毒不存在交叉反应，在用于大熊猫犬瘟热病毒检测时，灵敏度高，检出限为5×1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于大熊猫犬瘟热病毒检测的引物及探针，其特征在于，所述引物以Genbank登录号为KP793921的大熊猫源犬瘟热病毒giant panda/SX/2014株为模板设计；/n所述引物的上游引物F为：/n5’-[Biotin]AACGGAGGACCGGACGATTCGCACTGCTGG-3’；/n所述引物的下游引物R为：/n5’-CATCATTGAAGTGGATGGGGTATTTGTCTC-3’；/n与所述引物对应的探针为：/n5’-[FITC]CTCTTGTTGATGGTTGGGGGTTGTTGATTGGT(THF)GACTTCGGATCTTTC[C3-Spacer]-3’。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于大熊猫犬瘟热病毒检测的引物及探针，其特征在于，所述引物以Genbank登录号为KP793921的大熊猫源犬瘟热病毒giantpanda/SX/2014株为模板设计；
所述引物的上游引物F为：
5’-[Biotin]AACGGAGGACCGGACGATTCGCACTGCTGG-3’；
所述引物的下游引物R为：
5’-CATCATTGAAGTGGATGGGGTATTTGTCTC-3’；
与所述引物对应的探针为：
5’-[FITC]CTCTTGTTGATGGTTGGGGGTTGTTGATTGGT(THF)GACTTCGGATCTTTC[C3-Spacer]-3’。


2.一种用于大熊猫犬瘟热病毒检测的试剂盒，其特征在于，包括有权利要求1所述的引物及探针。


3.根据权利要求2所述的用于大熊猫犬瘟热病毒检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括有RNA标准阳性品为：
5’-GGCAUCACCAAGGAAGAGGCUCAGCUAGUG...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯娜，高玉伟，王建忠，黄培，王铁成，赵永坤，杨松涛，夏咸柱，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所，吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22