壬基酚聚氧乙烯醚半抗原和全抗原及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及壬基酚聚氧乙烯醚半抗原和全抗原及其制备方法与应用。利用本发明专利技术的全抗原免疫动物可以产生针对壬基酚聚氧乙烯醚的特异性抗体，可用于建立壬基酚聚氧乙烯醚的胶体金试纸条快速检测法，能用于对多种不同结构壬基酚聚氧乙烯醚的检测；所制备的胶体金检测试纸条操作简便，检测所需时间短，灵敏度高，稳定性好，成本低。

【技术实现步骤摘要】
壬基酚聚氧乙烯醚半抗原和全抗原及其制备方法与应用
本专利技术属于生物化工
，尤其是涉及壬基酚聚氧乙烯醚半抗原和全抗原及其制备方法与应用。
技术介绍
壬基酚聚氧乙烯醚(NonypHenolethoxylate，NPE)是一种烷基酚聚氧乙烯醚类化合物，是以壬基酚和环氧乙烷在催化剂作用下缩合反应生成的，其结构式如下：(n＝6～15)，当n＜15时为无色或微黄色透明液体，当n≥15时为白色膏体或固体。壬基酚聚氧乙烯醚作为非离子表面活性剂，可以促进碘的溶解，经常被用于奶牛乳头消毒剂助溶，处理不慎便会残留在牛乳中，由于其属于环境激素，对生物体繁殖系统具有危害，近年来已被欧美等国家禁止使用。2011年初，中国环保部口和海关总署发布的《中国严格限制进出口的有毒化学品目录》中已首次将壬基酚、对壬基酚和支链-4-壬基酚列为禁止进出口物质。常规对壬基酚聚氧乙烯醚的监测方法为仪器方法，如液相色谱和质谱联用法，但需要昂贵的仪器设备，操作需要专业技术人员，目前市场上无相应快速检测产品。专利申请号201310186034.X的中国专利技术专利，公开了壬基酚聚氧乙烯醚检测ELISA试剂盒的制备和使用方法，相比液相色谱和质谱联用法更便捷，但存在检测时间长，成本较高的缺点。而且由于壬基酚聚氧乙烯醚中乙氧基聚合数量的不同，导致NPE有不同的结构，常见的为NPE-6，NPE-7、NPE-8、NPE-9、NPE-10、NPE-12，具有相近的理化性质且都具有毒性，国内外市场未见有商品化广谱检测NPE的试纸条和试剂盒的检测产品。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种壬基酚聚氧乙烯醚半抗原和全抗原及其制备方法，还提供一种用于对多种不同结构壬基酚聚氧乙烯醚检测的胶体金检测试纸条。NPE中由于随着乙氧基聚合数量的不同有不同的结构，专利技术人通过化学方法对NPE的结构进行改造，使其能更好的与载体蛋白偶联。用偶联得到的抗原免疫小鼠，得到的单克隆抗体分别与不同结构NPE做交叉反应，筛选得到能与NPE-6，NPE-7、NPE-8、NPE-9、NPE-10、NPE-12均能交叉反应的广谱的单克隆抗体。本专利技术将偶联抗原与单克隆抗体应用到免疫层析试纸条中，制作出胶体金检测试纸条，经验证具有较高的灵敏度、准确率和稳定性。本专利技术的目的在于提供一种壬基酚聚氧乙烯醚半抗原，其结构式如下所示：n＝6～15。本专利技术还提供一种壬基酚聚氧乙烯醚全抗原，由上述壬基酚聚氧乙烯醚半抗原与载体蛋白偶联后得到。其中，所述载体蛋白选自牛血清蛋白、钥孔嘁血蓝蛋白或卵清蛋白，γ-球蛋白；优选地，为牛血清蛋白和卵清蛋白。本专利技术还提供由上述壬基酚聚氧乙烯醚全抗原制备的特异性抗体，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。本专利技术还提供由上述壬基酚聚氧乙烯醚半抗原，或上述壬基酚聚氧乙烯醚全抗原，或上述特异性抗体制备的壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂或试剂盒。本专利技术还提供由上述壬基酚聚氧乙烯醚半抗原，或上述壬基酚聚氧乙烯醚全抗原，或上述特异性抗体，或上述检测试剂在制备壬基酚聚氧乙烯醚的胶体金检测试纸条中的应用。上述壬基酚聚氧乙烯醚半抗原的制备方法，具体包括：分别取NPE-7、NPE-9、NPE-10标准品，用二氯甲烷溶解，加入Dess-Martin氧化剂，冰水浴反应后滴加超纯水，淬灭、离心取上清，将上清液用二氯甲烷溶解，加入6-氨基乙酸，磁力搅拌下室温反应，加入NaBH(OAc)3，继续反应后加入饱和NaCl水溶液淬灭，用HCl调节pH，加入二氯甲烷萃取，饱和NaCl水溶液洗后，用无水Na2SO4干燥，旋干，即得壬基酚聚氧乙烯醚半抗原。上述壬基酚聚氧乙烯醚全抗原的制备方法，具体包括：用二甲基甲酰胺溶解壬基酚聚氧乙烯醚半抗原，加入N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺活化，得到壬基酚聚氧乙烯醚半抗原活化液；将载体蛋白溶解于磷酸盐缓冲溶液，得到载体蛋白溶液；将壬基酚聚氧乙烯醚半抗原活化液缓慢滴加到载体蛋白溶液中，室温搅拌，用磷酸盐缓冲溶液透析，换液后收取，即得壬基酚聚氧乙烯醚全抗原。上述本专利技术的制备方法各合成步骤中所述的固定值仅是优化后数值，但是本专利技术的保护范围不限于此，只要能够合成相应的壬基酚聚氧乙烯醚半抗原和全抗原化合物，应均属于本专利技术的保护范围。本专利技术所合成的壬基酚聚氧乙烯醚半抗原端基为羧基,可以在有机溶剂中先行与N-羟基琥珀酰亚胺反应转化成活性酯,更高效的与各种载体蛋白上的氨基反应。上述壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体的制备：用所得壬基酚聚氧乙烯醚全抗原为免疫原交叉免疫小鼠，取免疫小鼠的血清，分别检测抗血清对壬基酚聚氧乙烯醚的效价和抑制价，选取效价和抑制价较高的免疫小鼠，取所得免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株，并取不完全佐剂腹腔注射进行致敏后的小鼠，将杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，腹水纯化，得到纯化的壬基酚聚氧乙烯醚抗单克隆抗体。所述具体效价及抑制反应检测使用ELISA方法。上述单克隆抗体制备过程还包括筛选步骤，即将所得纯化的单克隆抗体分别与常见的NPE-6，NPE-7、NPE-8、NPE-9、NPE-10、NPE-12以及壬基酚、辛基酚、聚氧乙烯醚标准品进行交叉反应，能与NPE-6，NPE-7、NPE-8、NPE-9、NPE-10、NPE-12均发生交叉抑制反应，且不与壬基酚、辛基酚、聚氧乙烯醚发生抑制反应或抑制反应较小，即为所需要筛选的广谱的NPE单克隆抗体。一种胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条包括PVC背衬、样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，所述PVC背衬一端依次粘贴样品垫、硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫，所述硝酸纤维素膜上包被了壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原作为检测线，和兔抗鼠二抗作为质控线，配套使用的微孔板上包被了壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体-胶体金标记物。上述壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体-胶体金标记物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：(1)制备胶体金颗粒：用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成胶体金颗粒；取氯金酸水溶液500～1000ml加热至沸腾，持续搅拌的情况下加入柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌加热至溶液呈透亮的红色，室温冷却，用去离子水恢复到原体积，4℃保存；(2)壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体-胶体金标记物的制备：取上步制备的胶体金加入K2CO3溶液调节pH值，再加入筛选纯化后的单克隆抗体，混匀后静置，加入聚乙二醇20000溶液后离心，弃上清，加入复溶液，混合均匀，即得壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体-胶体金标记物，所述复溶液为0.05M三羟甲基氨基甲烷配合5％蔗糖。将胶体金标记好的壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体按每孔3～10μL用冻金稀释液(0.05M三羟甲基氨基甲烷+5％蔗糖)稀释混匀后分装于96孔板，放置在冻干机内冻干。上述胶体金检测试纸条中所述硝酸纤维素膜所做处理如下：将壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原，均匀喷涂在硝酸纤维素膜检测线的位置，并同时喷涂兔抗鼠二抗质控线，烘干后拿出，干燥本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种壬基酚聚氧乙烯醚半抗原，其特征在于，其结构式如下所示：

【技术特征摘要】
1.一种壬基酚聚氧乙烯醚半抗原，其特征在于，其结构式如下所示：n＝6～15。


2.一种壬基酚聚氧乙烯醚全抗原，其特征在于，由权利要求1所述壬基酚聚氧乙烯醚半抗原与载体蛋白偶联后得到。


3.由权利要求2所述壬基酚聚氧乙烯醚全抗原制备的特异性抗体。


4.由权利要求1所述壬基酚聚氧乙烯醚半抗原，或权利要求2所述壬基酚聚氧乙烯醚全抗原，或权利要求3所述特异性抗体制备的壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂或试剂盒。


5.权利要求1所述壬基酚聚氧乙烯醚半抗原，或权利要求2所述壬基酚聚氧乙烯醚全抗原，或权利要求3所述特异性抗体，或权利要求4所述所述检测试剂在制备壬基酚聚氧乙烯醚的胶体金检测试纸条中的应用。


6.权利要求1所述壬基酚聚氧乙烯醚半抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
分别取NPE-7、NPE-9、NPE-10标准品，用二氯甲烷溶解，加入Dess-Martin氧化剂，冰水浴反应后滴加超纯水，淬灭、离心取上清，将上清液用二氯甲烷溶解，加入6-氨基乙酸，磁力搅拌下室温反应，加入NaBH(OAc)3，继续反应后加入饱和NaCl水溶液淬灭，用HCl调节pH，加入二氯甲烷萃取，饱和NaCl水溶液洗，用无水Na2SO4干燥，旋干，即得壬基酚聚氧乙烯醚半抗原。


7.权利要求2所述壬基酚聚氧乙烯醚全抗原的制备方法，其特征在于，用二甲基甲酰胺溶解壬基酚聚氧乙烯醚半抗原，加入N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺活化，得到壬基酚聚氧乙烯醚半抗原活化液；将载体蛋白溶解于磷酸盐缓冲溶液，得到...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨春江，
申请(专利权)人：北京纳百生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11